UK 
EnglishТипова
Polski✂️ CRISPR-Cas9 Редагування Геному
Анімація CRISPR-Cas9: направляюча РНК сканує ДНК, розпізнавання PAM, розрізання обох ланцюгів та шляхи репарації NHEJ/HDR.
Схожі симуляції
Про CRISPR-Cas9 редагування геному
Ця симуляція проводить через семиетапний механізм CRISPR-Cas9: білок Cas9 і напрямна РНК (gRNA) утворюють комплекс, сканують ДНК на наявність послідовності PAM (5'-NGG-3'), розкручують подвійну спіраль, утворюючи R-петлю, перевіряють комплементарність усіх 20 нуклеотидів спейсера, і, нарешті, розрізають обидва ланцюги за допомогою нуклеазних доменів RuvC та HNH. Користувачі можуть змінювати кількість неспарованих основ у напрямній РНК і спостерігати, як ефективність розрізання експоненційно падає за формулою e^(-0,35 × кількість неспарованих основ). Після розрізання можна обрати або NHEJ (схильне до помилок з'єднання, що створює інделі), або HDR (точну репарацію за шаблоном).
CRISPR-Cas9 було адаптовано з бактеріальної адаптивної імунної системи, і він став провідним інструментом сучасної генної інженерії — від фундаментальних досліджень і валідації мішеней для ліків до клінічної генної терапії серпоподібноклітинної анемії та спадкової сліпоти.
Часті запитання
Що таке CRISPR-Cas9 і як він працює?
CRISPR-Cas9 — це двокомпонентна система редагування геному, що складається з ендонуклеази Cas9 і синтетичної напрямної РНК (gRNA). gRNA містить 20-нуклеотидну спейсерну послідовність, яка спарюється з комплементарною ділянкою в геномі, спрямовуючи Cas9 у точне місце. Після зв'язування Cas9 розрізає обидва ланцюги ДНК-спіралі, утворюючи дволанцюговий розрив, який клітина має репарувати.
Як користуватися елементами керування симуляцією?
Натисніть «Далі», щоб перейти до наступного кроку механізму, або «Авто», щоб анімація йшла автоматично. Повзунок «Невідповідності» додає неспаровані основи між напрямною РНК і мішенню, що знижує ефективність розрізання, показану на панелі статистики. Досягнувши кроку 7, активуйте кнопки «Репарація NHEJ» або «Репарація HDR», щоб побачити два різні результати репарації розриву ДНК.
Що таке послідовність PAM і навіщо вона потрібна Cas9?
PAM (мотив, суміжний із протоспейсером) — це коротка послідовність ДНК — 5'-NGG-3' для широко вживаного SpCas9 — розташована безпосередньо з 3'-боку від цільової ділянки на нематричному ланцюгу. Cas9 спочатку має зв'язатися з PAM, перш ніж зможе розкрутити ДНК і перевірити комплементарність напрямної РНК. Без дійсного PAM Cas9 не розріже навіть ідеально відповідну послідовність, що обмежує позацільову активність по всьому геному.
Який математичний зв'язок між кількістю невідповідностей напрямної РНК та ефективністю розрізання?
Ефективність розрізання експоненційно спадає зі збільшенням кількості невідповідностей: Ефективність = e^(-0,35 × кількість невідповідностей). За нуля невідповідностей ефективність становить 100%; за 5 невідповідностей вона падає приблизно до 17%; за 8 невідповідностей опускається нижче 6%. Невідповідності в «насіннєвій ділянці» (нуклеотиди 1-12, суміжні з PAM) значно більш руйнівні, ніж ті, що розташовані ближче до 5'-кінця спейсера.
Що таке NHEJ і HDR і коли активується кожен шлях?
Негомологічне з'єднання кінців (NHEJ) активне практично в усіх фазах клітинного циклу і швидко з'єднує розірвані кінці, але часто вносить невеликі вставки чи делеції (інделі), що порушують рамку зчитування — корисно для нокауту генів. Репарація, спрямована гомологією (HDR), використовує наданий донорський шаблон ДНК для точних правок, але ефективна лише у фазах S і G2 клітинного циклу, коли доступна сестринська хроматида, що робить її менш практичною в постмітотичних тканинах.
Чи використовується CRISPR-Cas9 у реальних медичних методах лікування?
Так. Наприкінці 2023 року FDA США схвалило Casgevy (exagamglogene autotemcel) — першу терапію на основі CRISPR — для лікування серпоподібноклітинної анемії та трансфузійно-залежної бета-таласемії. Лікування редагує власні стовбурові клітини пацієнта ex vivo, щоб реактивувати вироблення фетального гемоглобіну. Додаткові терапії CRISPR перебувають у клінічних випробуваннях для лікування спадкової сліпоти (мутація CEP290), деяких видів раку та ВІЛ.
Хто і коли відкрив редагування генів за допомогою CRISPR-Cas9?
Програмоване використання Cas9 для редагування геному було продемонстровано у знаковій статті 2012 року Дженніфер Дудни (Каліфорнійський університет у Берклі) та Емманюель Шарпантьє (тоді в Університеті Умео), опублікованій у журналі Science. Вони показали, що одна напрямна РНК може спрямувати Cas9 для розрізання конкретної ДНК-мішені in vitro. Наступного року Фен Чжан з Інституту Броуда та інші групи продемонстрували редагування в клітинах ссавців. Дудна та Шарпантьє отримали Нобелівську премію з хімії 2020 року за це відкриття.
Які інші симуляції з молекулярної біології пов'язані з CRISPR?
Редагування CRISPR тісно пов'язане з реплікацією ДНК (яка має відбутися для роботи HDR), згортанням білків (білок Cas9 зазнає конформаційних змін під час зв'язування з gRNA та ДНК), поділом клітин / мітозом (ефективність HDR залежить від фази клітинного циклу) та ферментативною кінетикою (Cas9 поводиться як послідовність-специфічна рестрикційна ендонуклеаза з настроюваною специфічністю). Симуляція дифузії через мембрану актуальна для розуміння того, як вектори доставки CRISPR (ліпідні наночастинки) перетинають клітинну мембрану.
Як CRISPR-Cas9 доставляється в клітини на практиці?
Поширені методи доставки включають вірусні вектори (особливо аденоасоційований вірус, AAV, для доставки in vivo), ліпідні наночастинки (LNP, використані в терапії Casgevy), електропорацію рибонуклеопротеїнових (RNP) комплексів для редагування клітин ex vivo та плазмідну трансфекцію для лабораторного використання. Кожен метод має компроміси між ефективністю, специфічністю до типу клітин, імунною відповіддю та розміром вантажу — AAV має пакувальний ліміт приблизно 4,7 т.п.н., що обмежує деякі більші варіанти Cas9.
Які нинішні перспективні напрями та відкриті виклики технології CRISPR?
Активні напрями досліджень включають базове редагування (перетворення однієї основи ДНК на іншу без дволанцюгового розриву), прайм-редагування (підхід «пошук і заміна» з використанням злиття зі зворотною транскриптазою), епігеномне редагування (з використанням каталітично неактивного dCas9, злитого з метилтрансферазами або деметилазами) та системи CRISPRa/CRISPRi для активації чи пригнічення генів без будь-якого розрізання ДНК. Відкриті виклики включають ефективну доставку in vivo до таких тканин, як мозок і м'язи, зниження імуногенності бактеріального Cas9 у людей та регуляторні рамки для редагування зародкової лінії.