Синтетична Біологія: Інженерія Живих Систем

Вступ до синтетичної біології

Синтетична біологія застосовує інженерні принципи – стандартизацію, модульність, абстракцію та ітеративні цикли проєктування-будування-перевірки – для проектування та створення нових біологічних частин, схем та систем. Будуючи на основі молекулярної біології та генетичної інженерії, синтетична біологія йде за межі модифікації існуючої біології до побудови абсолютно нових біологічних функцій або організмів. Зважаючи на знакові демонстрації програмованих генетичних схем (генетичний перемикач та реплілятор у 2000 році), ця галузь розширилася, щоб вирішувати завдання проєктування біосенсорів, метаболичеської інженерії, програмування терапії клітин, біовиробництва та екологічних застосувань.

Ключові концепції синтетичної біології включають стандартизовані біологічні частини (реєстр BioBrick характеристикованих генетичних компонентів – промотори, місця зв’язування рибосоми, кодуючі послідовності, термінатори), ортогональні (не взаємодіючи) молекулярні інструменти, хостальні організми (добре вивчені санокси для розгортання схем – *E. coli*, *S. cerevisiae*, клітини CHO) та кількісний прямий дизайн генетичних схем із передбачуваною поведінкою. Прогрес у синтезі ДНК, редагуванні геному на основі CRISPR та обчислювальному дизайні тепер дозволяє будувати складні генетичні схеми в геномі з зростаючою надійністю, від демонстрацій концепції до промислових і клінічних застосувань.

Генетичні схеми та логічні ворота

Перемикачі та пам’ять

Генетичний перемикач Гарднера (2000) побудований у плазмі *E. coli* з двома взаємопригнічуючими генами-репресорами факторів транскрипції. Обидва репресори можуть домінувати залежно від початкових умов та зовнішніх сигналів; система проявляє бістабільність – перемикання між двома стабільними станами та збереження пам’яті про тригер сигналу після його видалення. Біологічні схеми пам’яті дозволяють клітинам записувати вплив сигналу, інтегрувати кілька сигналів з часом або підтримувати різні програми експресії генів у генетично ідентичних клітинах. Застосування включають відстеження росту в розвитку (маркування клітин, які зазнали певного сигналу), біосенсоринг минулих впливів навколишнього середовища та терапію клітин з програмованим прийняттям рішень.

Логіка Булевих операцій у клітинах

Штучно створені генетичні схеми можуть реалізовувати логічні операції Буля з використанням інженерних факторів транскрипції або регуляторів РНК. Шлюзи типу AND активують вихід лише тоді, коли присутні обидва входи (наприклад, промотор, що потребує двох факторів транскрипції). Шлюзи типу OR активуються з одного з входів; шлюзи типу NOT інвертують сигнали входу. Схеми багатошарового поєднання логічних воріт реалізують складні схеми «якщо-то-інакше» у живих клітинах. Логічні ворота на основі РНК, що використовують рибозими, перемикачі типу «toehold», та CRISPRi/a, забезпечують швидку програмовувану логіку в клітинах ссавців. Клітини CAR-T проектуються з логікою AND, яка вимагає одночасного наявності як антигену A, так і B для активації – зменшуючи побічні ефекти при цільовому впливі за рахунок специфічності до двох антигенів.

Інженерія метаболізму

Біотворення цінних сполук

Інженерія метаболізму переробляє та розширює метаболічні шляхи в мікроорганізмах для виробництва цінних речовин – ліків, біопалива, матеріалів. Виробництво артемізину в *Saccharomyces cerevisiae* (Артем Кізінг, UC Berkeley) було досягнуто завдяки інженерії 12 генів, включаючи артемізинові синтетази з *Artemisia annua*, що дозволило отримати комерційно важливий антималярійний артемізин незалежно від варіабельності виробництва з рослин – зменшивши витрати на виробництво на 90%. Виробництво попередника таксилу в *Escherichia coli* та *Saccharomyces cerevisiae* демонструється на рівні дослідницьких масштабів. Шіконовини барвники, ресвератрол, ванілін і багато інших сполук, які раніше видобувалися з рослин або очищувалися хімічним шляхом, тепер виробляються мікроорганізмами більш стійким способом.

Біопаливо нового покоління

Біопаливо з кращими характеристиками, ніж етанол – ізобутиловий спирт, ефіри жирних кислот, алкани – виробляється за допомогою інженерії *E. coli* та дріжджів. Стратегії інженерії включають усунення конкуруючих шляхів, надмірне експресування ферментів-ключових (визначених за допомогою аналізу метаболічного потоку), балансування кофакторів (забезпечення доступності NADPH для біосинтетичних реакцій) та толерантність до продукту – багато видів біопалива є токсичними для виробляючих організмів при високих концентраціях, інженерія складу мембран, вихідних насосів та стресових реакцій покращує вміст. Життєві цикли інженерних мікроорганізмів-біопалива можуть показувати зменшення викидів парникових газів на 50–80% порівняно з викопним паливом, хоча економічна конкурентоспроможність залежить від цін на нафту.

Синтетичні геноми та мінімальні клітини

Прогрес у синтезі ДНК дозволяє будувати цілі мікробні геноми з нуля. Команда Крейга Вентера синтезувала геном *Mycoplasma mycoides* завдовжки 1,08 Мб, використовуючи 1078 фрагментів ДНК, зібраних у дріжджах та пересаджених в клітину *M. capricolum*, позбавлену ядра – таким чином було створено першу синтетичну бактеріальну клітину (JCVI-syn1.0, 2010). Подальший дизайн і будівництво JCVI-syn3.0 з лише 473 генами (мінімальний необхідний геном) створило клітини з найменшим відомим геномом самовідтворювальної організми, при цьому 149 генів все ще мали невідому функцію – це показало, наскільки фундаментальна біологія клітин залишається невідомою. Синтетичні хромосоми *Saccharomyces cerevisiae* (проєкт Sc2.0) перепроектують 16 хромосом *S. cerevisiae* за допомогою синтетичного дизайну, що дозволяє геномне рекомбінування для еволюційних досліджень.

Приклади та застосування

Приклад 1: Виробництво артемісину Лабораторія Кіслінга спроектувала *S. cerevisiae* для виробництва артемісінічної кислоти – попередника препарату артемісін проти малярії – за допомогою 12-крокового гетерологічного шляху, що включає підвищення активності мевалонатного шляху, синтез амфордієну, пероксидацію P450 та численні редокс-реакції. Після понад 150 років метаболічної інженерії промислове виробництво було передано Sanofi, яке виробляє від 35 до 60 тонн артемісину на рік. Проект трансформував глобальну стабільність поставок артемісину, демонструючи, що синтетична біологія може вирішувати проблеми з постачанням ліків для незлічених хвороб, і Кіслінгу було присуджено численні нагороди, що стимулювало подальші інженерні біологічні програми виробництва інших антималярійних препаратів та лікарських засобів від раку.

Приклад 2: Виробництво паства з бобру Паства бобра сильніша за сталь за масою, а на витривалість – ніж кевлар, але бобри не можуть бути вирощені (територіальні, пожирають один одного). Синтетична біологія перенесла гени пастви з бобрів (MaSp1, MaSp2 від *Nephila* бобрів) до кіз, метеликів, *E. coli* та дріжджів для виробництва білків пастви. Pioneer Biotech/Bolt Threads і Spiber виробляють інженерні білки пастви в дріжджах у промислових масштабах, які обробляються волокнами з налаштованими властивостями. AMSilk у Німеччині виробляє білки пастви в *E. coli* для покриттів медичних пристроїв і косметики особистого догляду. Застосування охоплюють від розкішних тканин до хірургічних шовних матеріалів, каркасів для інженерії тканин та матеріалів з ударостійкості.

Приклад 3: Редактори базових генів CRISPR Технологія редагування базових генів від Кріста Лау створила однонуклеотидних змін без подвійних розривів. Редактори цитозинових основ (CBE) деамінують цитозин до урацилу (читається як тимін) в межах вікна редагування 4-8 нм за допомогою nCas9 nickase, з'єднаного з ферментом деамінази. Редактори аденіну (ABE) перетворюють аденін на інозин (читається як гуанін). Разом конверсії C-у T та A-у G покривають приблизно 30% відомих спадкових точкових мутацій. Редагування Prime (2019) розширює це до всіх 12 можливих типів заміни, невеликих вставлень і видалень. Проводяться клінічні випробування за допомогою редакторів базових генів для виправлення мутацій синього кисточка, варіантів PCSK9 та HBV інтеграції – дивовижно точне геномне редагування, забезпечене біоінженерією.

Приклад 4: Програмовані клітинні терапії Підходи типу SYNTHECON інженерують Т-клітини з комплексними схемами прийняття рішень, що поєднують експресію CAR, кофакторні домени, гени самознищення та логічні ворота. Клітини 'SYNC' експресують два CAR (для двох антигенів) з інтегрованою AND-воротами – вбивають лише клітини, що виражають обидва антигени, зменшуючи пошкодження здорових тканин. Синусоїдні схеми активації генної експресії лише тоді, коли рецептор зв'язується зі специфічним лігандом, дозволяють клітинне самоусвідомлення та відповідь на специфічні комбінації антигенів пухлини. Шлюзи безпеки за допомогою RQR8 (чутливого до рутіксіма CD20-подібного мітку, що інтегрований в інженерні клітини) дозволяють швидко усунути терапевтичні клітини за допомогою рутіксіму, якщо виникає токсичність. Ці програмовані функції безпеки та специфічності дозволяють CAR-T клітинам боротися з пухлинами твердих тканин із більшою різноманітністю цілей.

Приклад 5: Генетична біоконтейнеризація Розвантаження генетично модифікованих організмів в навколишнє середовище вимагає стратегій утримання, щоб запобігти поширенню в навколишньому середовищі. Біологічне утримання еволюціонує організми, що потребують незвичайних амінокислот (UAA) включених у важливі гени – організми гинуть без хімічно синтезованих UAA в їх середовищі. Автотрофія для синтетичних сполук, яких немає в природі, запобігає розмноженню за межами визначених середовищ. Бактерії MAGE від Гарвардського університету мають усі 321 стоп-коди TAG перепризначені на включення UAA – заміна геному завбільшки 3,8 Мб забезпечує міцне утримання організмів, одночасно демонструючи здійсненність масштабування генетичного коду організму. Регуляторні рамки для випуску в навколишнє середовище утримуваних синтетичних організмів розвиваються у міру розвитку застосунків генного драйву та інженерії навколишнього середовища.

Приклад 6: Безклітинна синтетична біологія Безклітинні системи використовують очищені транскрипційні та перекладальні машини поза живими клітинами для виробництва білків або виконання генетичних схем без живих клітин. Система PURE відтворює транскрипцію-переклад *E. coli* з 36 очищених білків і є дуже налаштовуваною. Безклітинні системи дозволяють швидку прототипування генетичних схем (3-8 годин проти днів у клітинах), синтез токсичних білків, включення незвичайних амінокислот без інженерії живих клітин та діагностика на місці (SHERLOCK, DETECTR – безклітинні CRISPR-засновані виявлення нуклеїнових кислот). Заморожені безклітинні реакції можуть бути відновлені на полі або в малоресурсних умовах, що дозволяє портативні біосенсори для інфекційних захворювань, виявлення забруднень та контролю безпеки харчових продуктів.

Приклад 7: Генні драйви Генні драйви – це системи синтетичної біології, які спотворюють успадкування за межами медіанного значення 50%, яке очікується, поширюючи генетичні модифікації через дикі популяції. CRISPR-драйви обрізають дикий тип алелей і копіюють драйвний алель через HDR, досягаючи >90% успадкування. Запропоновані застосування: розповсюдження генів, стійких до малярії, через популяції *Anopheles* комахи; придушення популяцій інвазивних пустинних тварин на острові-консерваторських територіях; зменшення здатності *Aedes aegypti* передавати денге/жіка. Екологічні ризики, перетин кордонів, зворотність та управління є надзвичайно важливими; daisy-chain драйви (вимагають лише модифікованих популяцій з кількома генетичними елементами для підтримки) і регіональні драйви (обмежені ізольованими популяціями) розробляються як архітектури, що пом’якшують ризики.

Приклад 8: Інженерні живі матеріали Інженерні живі матеріали (ЖМ) поєднують синтетичну біологію з наукою про матеріали для створення матеріалів, які ростуть, самовідновлюються, відчувають навколишнє середовище та еволюціонують. Лабораторія Войта спроектувала *E. coli* для виробництва білків біоплеки, утворюючи наноструктури з електронної провідності або контрольованих механічних властивостей за допомогою генетичної програмування складу волокон curli. Живий бетон включає фотосинтезуючі синьогнійні бактерії в агрегати піску; бактеріальне мінералове утворення зміцнює композит, а бактерії залишаються живими і можуть мінералізувати тріщини. Матеріали на основі шовку включають інженерні клітини, які відчувають та реагують на вхідні дані. ЖМ можуть забезпечити самовідновлення інфраструктури, гібридні пристрої біо-електроніка та робототехніку, що живляться живими клітинами.

Спробуйте онлайн

Все вище працює у вашому браузері – відкрийте Синтетичну біологію: Інженерія живих систем і змінюйте параметри під час роботи. Не встановлюється нічого, не завантажується нічого, весь модель живе в одному вікні.

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Synthetic Biology: Engineering Living Systems і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.