Біологія стовбурових клітин та регенеративна медицина

Вступ до біології стовбурових клітин

Стовбурові клітини визначаються двома ключовими властивостями: самовідновлення – здатність ділитись та виробляти ідентичні дочірні клітини, підтримуючи пул стовбурових клітин, та потенційність – здатність диференціюватись у спеціалізовані клітинні типи. Ці властивості, які підтримуються окремими молекулярними механізмами, дозволяють стовбуровим клітинам підтримувати гомеостаз тканин протягом життя та реагувати на пошкодження. Потенційність стовбурових клітин є ієрархічною: тотопотентні клітини (зигота) можуть утворювати всі ембріональні та позаембріональні тканини; плюрипотентні клітини (внутрішня клітинова маса, ембріо-стовбурові клітини) утворюють усі ембріональні тканини; мультипотентні стовбурові клітини, специфічні для тканин (гематопоєтична, нервова, кишківник), генерують конкретні лінії.], [

Ембрийонічні стовбурові клітини

Мережі плюропотенції

Плюропотенція ембріонихчих стовбурових клітин (ESC) підтримується основним транскрипційним факторним мережею: OCT4, SOX2 та NANOG утворюють взаємозв’язаний ауторегуляторний ланцюг, який активує власну експресію та експресію інших факторів, одночасно пригнічуючи гени диференціації. Цільовими генами мережі плюропотенції є як активні гени, необхідні для ідентичності ESC, так і бівалентні гени – несуть як активний відмітку H3K4me3, так і репресивну відмітку H3K27me3 – які готові до активації при диференціації. Сигналювання LIF-STAT3 та BMP-SMAD підтримує самовідновлення мишей ESC; людські ESC потребують сигналу FGF та Activin/Nodal-SMAD2/3 – що відображає відмінності між ембріональними станами,

Направлене диференціювання плюропотенційних клітин

Протоколи направленого диференціювання послідовно експонують плюропотенційні клітини до факторів росту та малых молекул, які імітують сигнали ембріонального розвитку, щоб генерувати конкретні типи клітин. Кардіоміоцити отримуються шляхом мезодермальної індукції (активація Wnt, BMP), специфікації кардіального мезодерму (інхібація Wnt, FGF) та зрілості кардіоміоцитів (загалом 30-40 днів). Бета-клітини підшлункової залози потребують шестиетапної диференціації (визначений ендодерм, прогентор підшлункової залози, ендокринний прогентор, бета-клітина) протягом 30-40 днів. Ці протоколи дозволяють проводити тестування лікарських засобів на клітинних типах, що мають відношення до захворювань, моделювання захворювань у кардіоміоцитах, отриманих з iPSC пацієнтів, та, зрештою, застосувати клітинну терапію.

Дорослі стовбурові клітини та тканини

Еритроцитарні стовбурові клітини (ЕСК), що містяться в дорослих кістках, забезпечують безперервне виробництво кров’яних тілець протягом усього життя з пулу приблизно 10 000 ЕСК. ЕСК експресують маркери EPCR, CD150, CD48-; вони самовідтворюються за допомогою асиметричного поділу та генерують усі лінії кров’яних тілець через ієрархічні зобов'язання прогенітів. Тканинний ніж—остеобласти, клітини ретикулярної сітки, багаті на CXCL12, синусоїдальна ендотелія, мегакаріоцити, симпатичні нерви—надає сигнали (SCF, CXCL12, Ang-1, тромбопоетін), які підтримують спокій та самовідновлення ЕСК. Трансплантація ЕСК (кістковий мозковий пересадка) використовується для лікування гематологічних злояківних новоутворень та успадкованих захворювань; редагування ЕСК пацієнтів за допомогою CRISPR для виправлення мутацій, що викликають ознаку «зморшкуватий» (sickling), або активація ембріональної гемоглобіну пропонує генетичні терапії з метою одужання.

Кишкові стовбурові клітини

Килимок кишківника оновлюється кожні 3-5 днів, підтримуючись Lgr5+ стовбуровими клітинами базових колонок крипт. Сигнал Wnt від клітин Панетха та строми в крипті підтримує ідентичність стовбурових клітин; градієнт BMP з кінчика вілласа до основи крипти обмежує зону стовбурових клітин нижнім краєм. Сигнал Notch регулює долю поглинальних (клітин-глобул) та секреторних клітин. Lgr5+ кишкові стовбурові клітини були першими стовбуровими клітинами, вирощеними в органоїдах—тривимірні самоорганізовуються структури, які безперервно відтворюють архітектуру крипт-вілласів *in vitro* за допомогою EGF, Noggin та R-spondin (cocktail ENR). Органоїди кишківника використовуються для тестування лікарських препаратів, персоналізованої медицини, моделювання захворювань і дослідження регенеративних можливостей.

Органоїди

Органоїди – це самоорганізуючі 3D-тканинні структури, що вирощуються з стовбурових клітин, таких як ембріональні або дорослі, в матричних гелях. Органоїди головного мозку, що розвиваються протягом 40–70 днів з iPS-клітин, відтворюють шарування середнього мозку, включаючи прогени, зовнішні радіальні глиї та кортикозні нейрони – моделюючи мікроцефалію, патологію вірусу Зіка в головному мозку та розлади аутистичного спектру у специфічних для пацієнта моделях. Органоїди печінки, отримані з холангіоцитів і гепатоцитів, самозбираються, формуючи біліарні та паренхімальні компоненти, що моделює NASH, жовтязну хворобу та токсичність лікарських засобів. Органоїди нирок містять нефрони (подоцити, клітини проксимального каналу), корисні для вивчення мутацій полікістозної хвороби нирок. Пацієнтські органоїди пухлин прогнозують відповідь на хіміотерапію в клінічних дослідженнях, що відповідають пацієнту.

Приклади та застосування

Цей приклад демонструє терапію за допомогою CRISPR з використанням стовбурових клітин для лікування серповидної анемії, де редагування гену BCL11A відновлює вироблення гемоглобіну, що не уражується, забезпечуючи довготривале коригування. У клінічних випробуваннях усі пацієнти з серповидною анемією та бета-таласемією були без кризів ураження при лікуванні протягом 12 місяців і більше.

Два CRISPR-засновані генотерапевтичні підходи (CTX001 та Lyfgenia) отримали схвалення в кінці 2023 року – перші схвалені терапії на основі CRISPR. CTX001 редагує ген BCL11A, що є підвищувачем, у гемахемтопоетичних стовбурових клітинах пацієнта, щоб активувати фетальний гемоглобін (HbF), який не уражується, забезпечуючи довготривале коригування. У випробуваннях усі лікувані пацієнти з серповидною анемією та бета-таласемією були без кризів ураження при лікуванні протягом 12 місяців і більше. Lyfgenia вставляє скоригований ген HBB за допомогою вектору лентивіруса.

Приклад 2 демонструє терапію CAR-T клітинами, де генетично модифіковані T-клітини пацієнта використовуються для лікування злоякісної гістіоцитарної лімфоми (ЗГЛ). У пацієнтів з рецидивуючою/непрогресуючою ЗГЛ, CAR-T досягло більш ніж 80% повного виліковування проти приблизно 0% для хіміотерапії. Axicabtagene ciloleucel та tisagenlecleucel схвалені для ЗГЛ, DLBCL, фолікулярної лімфоми та множинної мієломи (BCMA CAR-T). Викликами є цитокінова реакція запалення (CRS), нейротоксичність, пов’язана з клітинами імунної відповіді (ICANS), коротка тривалість існування, уникнення антигену, складне виробництво та проблеми з виробництвом. Нові покоління CAR-T включають всі генотипні CAR-T, “броньовані” CAR-T з додатковими ко-стимулюючими ознаками та CAR-NK клітини.

Приклад 3 демонструє використання iPSC моделей захворювань, де пацієнтські специфічні iPSC моделі дозволяють вивчати генетичні захворювання людини в відповідних клітинних типах з фактичним мутаційним фоном пацієнта. Кардіоміоцити iPSC від пацієнтів з синдромом тривалого QT-інтервалу з мутаціями KCNQ1 показують розширені інтервали QT, ідентифіковано препарати, що зменшують фенотип тривалого QT, ALS iPSC-демонові моторні нейрони показують агрегацію TDP-43 та деформації аксонів, що передують клітинній загиблий; скринінгові препарати ідентифікували кандидати, які зменшують патологію TDP-43. iPSC моделі шизофренії показують знижену щільність синапсів у кортиковальних нейронах, що корелює з тяжкістю симптомів. Можливість отримати будь-який клітинний тип від генетичного фону будь-якого пацієнта революціонізує дослідження біології захворювань.

Приклад 4 демонструє використання церебральних органоїдів, де iPSC-демонові церебральні органоїди спонтанно самоорганізовуються в кору з венульарними зонами, що містять нейропрогенні клітини та зовнішню кори з нейронами. Органоїди MCPH1-мутованих iPSC показали фенотип передчасного диференціювання пацієнтів з мікроцефалією; органоїди, інфіковані вірусом Зіка, показали переважне знищення зовнішніх радіальних клітин, що пояснює мікроцефалію при вродженій інфекції Зіком – опубліковано у Science за кілька тижнів після спалаху, демонструючи швидкість органоїдів у вирішенні надзвичайних ситуацій охорони здоров’я. Коральні зрізи органоїдів на багатоелектродних масивах записують спонтанну електричну активність, що дозволяє фізіологічне фенотипування захворювань мозку.

Приклад 5 демонструє трансплантацію гематопоетичних стовбурових клітин, де всігенічна трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин лікує злоякісні лейкози (AML, ALL, CML, лімфома) шляхом заміни ракової гематопоезії клітинами донора, що забезпечують ефект перехресного зараження, – вплив донора на тканини господаря. HLA-відповідні донори визначають ризик захворювання перехресного зараження, – T-клітини в мармісі донора розпізнають тканини господаря як іноземні. Тілослідовування або посттрансплантаційний циклофосфамід зменшує захворювання перехресного зараження; хаплоідна (50% HLA-відповідний батько) трансплантація зараз є здійсненною з покращеним запобіганням захворюванню перехресного зараження, що значно розширює доступність донорів.

Приклад 6 демонструє заміну бета-клітин підшлункової залози, де тип 1 діабет виникає внаслідок аутоімунного руйнування інсулін-вироблюючих бета-клітин. Трансплантація ісел від мертвого донора забезпечує тимчасову незалежність від інсуліну, але потребує постійної імунної підтримки та обмежена доступність донорів масштабують проблему. Vertex Pharmaceuticals продемонструвала, що функціональні бета-клітини iPSC (VX-880), трансплантовані пацієнтам з діабетом 1 типу, відновили інсулін-реактивне виділення інсуліну в ранніх клінічних випробуваннях – знаковий потенційний метод лікування.

Приклад 7 демонструє терапію стовбуровими клітинами шкіри, де епідерміс підтримується базальними кератиноцитами-стовбурами, що експресують p63, SOX9 та інтегрин. У пацієнтів з опіками без достатньої кількості донорської шкіри для загоєння рани, вирощені ex vivo епітеліальні аутотрансплантати (CEAs) з невеликих зразків шкіри ростуть, що є порятунком життя. Генетична терапія кератиноцитів-стовбурів з скоригованим геном ламінін-332 відновила цілісність шкіри в синдромі епідермальної бляшки (JEB) – болючій хворобі бляшок, що усунено на 80% поверхні тіла італійського дитини (опубліковано у Nature у 2017 році), демонструючи довготривалий курс нормального загоєння тканини з генетично скоригованих попередників.

Приклад 8 демонструє трансплантацію органоїдів печінки, де пацієнти з холангіопатією з втратою жовчних проток (первинний склерозний холангіт, біліарна атрезія) мають обмежені варіанти лікування за межами трансплантації печінки. Проспективна ізоляція Lgr5+ клітин печінкових стовбурів дозволяє масове розширення, що призводить до диференціації в холангіоцити або гепатоцити, моделювання органоїдів. Трансплантація людських органоїдів печінки на мишах репонізувала орган і відновила функцію. Клінічні випробування аутологічної скоригованої трансплантації органоїдів печінки пацієнтів з синдромом прогресивного сімейного холестазу (PFIC) з скоригованим геном ATP8B1 та всігенічна трансплантація органоїдів печінки для гострого-хронічного захворювання печінки, що розвивається, набирають обертів – представляючи собою крайній рубеж терапевтичних застосувань органоїдів.

Спробуйте онлайн

Все вище працює у вашому браузері — відкрийте Stem Cell Lineage & Organoid Growth Explorer і змінюйте параметри під час роботи. Не встановлюється нічого, не завантажується нічого, весь модель живе в одному вікні.

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Stem Cell Lineage & Organoid Growth Explorer і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.