Biologia syntetyczna: Inżynieria żyjących systemów

Wprowadzenie do Biologii Syntetycznej

Biologia syntetyczna stosuje zasady inżynierii – standaryzację, modułowość, abstrakcję i cykle projektuj-buduj-testuj – w celu zaprojektowania i budowy nowych biologicznych elementów, obwodów i systemów. Bazując na molekularnej biologii i inżynierii genetycznej, biologia syntetyczna wykracza poza modyfikowanie istniejącej biologii do konstruowania zupełnie nowych funkcji lub organizmów. Od znaczących demonstracji programowalnych obwodów genetycznych (przełącznik genetyczny i repressilator w 2000 roku), dziedzina ta rozszerzyła się, aby rozwiązywać problemy związane z projektowaniem biosensorów, inżynierią metaboliczną, programowaniem terapii komórkowych, bioprodukcji oraz zastosowaniami środowiskowymi.

Kluczowe pojęcia w biologii syntetycznej obejmują standaryzowane elementy biologiczne (rejestr BioBrick charakteryzowanych komponentów genetycznych – sekwencje promotora, miejsca wiązania rybosomalnego, sekwencje kodujące, terminatory), ortogonalne (nie krzyżują się) narzędzia molekularne, organizmy-chasis (dobrze zbadane hosty do wdrażania obwodów – *E. coli*, *S. cerevisiae*, komórki CHO) i ilościowy projekt z przodu dla obwodów genetycznych o przewidywalnym zachowaniu. Postępy w syntezie DNA, edycji genomu CRISPR oraz projektowaniu komputerowym umożliwiają teraz budowę złożonych obwodów genetycznych w całym genomie ze zwiększoną niezawodnością, od demonstracji koncepcyjnych do zastosowań przemysłowych i klinicznych.

Obwody Genetyczne i Bramki Logiczne

Wymienne przełączniki i pamięć

Bramka genetyczna Gardnera (2000) zbudowała dwa wzajemnie hamujące geny czynnika transkrypcyjnego w plazmidzie E. coli. Jeden z tych regulatorów może dominować, w zależności od początkowych warunków i sygnałów zewnętrznych; system wykazuje dwustanowość – przełączanie się między dwiema stabilnymi stanami i utrzymywanie pamięci po usunięciu sygnału. Obwody pamięci biologicznej umożliwiają komórkom rejestrowanie ekspozycji na sygnał, integrowanie wielu sygnałów w czasie lub utrzymywanie różnych programów ekspresji genów w identycznych genetycznie komórkach. Zastosowania obejmują śledzenie linii rozwojowej w rozwoju (oznaczanie komórek, które doświadczyły określonego sygnału), biosensorykę dawnych ekspozycji środowiskowych i terapię komórkami z programowalnym podejmowaniem decyzji.

Logika Boole’owska w Komórkach

Wygenerowane obwody genetyczne mogą implementować operacje logiki Boole’owskiej przy użyciu zaprojektowanych czynników transkrypcyjnych lub regulatorów RNA. Bramki AND aktywują wyjście tylko wtedy, gdy oba wejścia są obecne (np. promotor wymagający dwóch czynników transkrypcyjnych). Bramki OR aktywują się z jednym z wejść; bramki NOT odwracają sygnały wejściowe. Obwody wielowarstwowe łączące bramki logiczne implementują złożone drzewa decyzyjne typu jeśli-to-wtedy-w przeciwnym razie w żywych komórkach. Bramki logiczne oparte na RNA, wykorzystujące rybozymy, przełączniki toe-hold i CRISPRi/a umożliwiają szybką programowalną logikę w komórkach ssaków. Komórki CAR-T są projektowane z bramkami AND wymagającymi obecności zarówno antygenu A, jak i B do aktywacji – zmniejszając toksyczność na celu off-tumour dzięki specyficzności dla dwóch antygenów.

Inżynieria metaboliczna

Biosyntetyzacja cennych związków

Inżynieria syntetyczna modyfikuje i rozszerza szlaki metaboliczne w mikroorganizmach, aby produkować cenne związki – leki farmaceutyczne, biopaliwa, materiały. Produkcja kwasu artemisynowego w *Saccharomyces cerevisiae* (Jay Keasling, UC Berkeley) obejmowała zaprojektowanie i wprowadzenie 12 genów, w tym artemisininy synteazy z *Artemisia annua*, do drożdży, co umożliwiło komercyjną produkcję antymalaryjnej artemisyny niezależnie od zmienności związanej z uprawą roślin – redukując koszt produkcji o 90%. Produkcja prekursora taksolu w *Escherichia coli* i *Saccharomyces cerevisiae* jest demonstrowana na poziomie badawczym. Kolory pigmentów shikoninowych, resweratrolu, waniliny oraz wiele innych związków wcześniej pozyskiwanych z roślin lub oczyszczanych ze syntezy chemicznej są produkowane w sposób bardziej zrównoważony przez zmodyfikowane mikroorganizmy.

Biopaliwa następnej generacji

Biopaliwa o lepszych właściwościach niż etanol – izobutanol, estry kwasów tłuszczowych i alkanowe – są produkowane przez zmodyfikowane *E. coli* i drożdże. Strategie inżynierii obejmują eliminację konkurujących szlaków metabolicznych, nadmierne ekspresowanie enzymów ograniczających przepływ (identyfikowanych za pomocą analizy przepływu metabolicznego), balansowanie kofaktorów (zapewnienie dostępności NADPH dla reakcji biosyntetycznych) i tolerancję produktu – wiele biopaliw jest toksycznych dla organizmów produkujących je w wysokich stężeniach – inżynieria składu błon, pomp wydalniczych i odpowiedzi stresogennych poprawia stężenia. Analizy cyklu życia zmodyfikowanych mikroorganizmów jako biopaliwa mogą pokazywać redukcję emisji gazów cieplarnianych o 50-80% w porównaniu z paliwami kopalnymi, choć konkurencyjność ekonomiczna zależy od cen ropy naftowej.

Syntezowane Genomy i Minimalne Komórki

Postęp w syntezie dna umożliwia konstrukcję całych genomów mikrobowych od zera. Zespół Craiga Venter'a zsyntetyzował 1,08 Mb genom Mycoplasma mycoides przy użyciu 1078 fragmentów dna złożonych w drożdżach i wszczepionych do komórki M. capricolum bez jądra—tworząc pierwszą syntetyczną komórkę bakteryjną (JCVI-syn1.0, 2010). Następny etap, czyli projektowanie i budowa JCVI-syn3.0 z jedynie 473 genami (minimalny niezbędny genom) stworzył komórki z najmniejszym znanym genomem samoreplikującego się organizmu, z 149 genami wciąż o nieznanej funkcji—ukazując ile fundamentalnej biologii komórkowej pozostaje nam jeszcze niezbadane. Syntezowane chromosomy drożdżowca (projekt Sc2.0) redysignują 16 chromosomów S. cerevisiae przy użyciu syntezy, umożliwiając rekombinację na poziomie genomu w badaniach ewolucji.

Przykłady i Zastosowania

Przykład 1: Produkcja Artemisininy Laboratorium Keaslinga zaprojektowało drożdże S. cerevisiae do produkcji kwasu artemisynowego – prekursoru leku przeciwmalarycznego artemisininy – poprzez 12-etapowy heterodenną ścieżkę metaboliczną, obejmującą podwyższanie szlaku mevalonianowego, syntezę amorfadiene, utlenianie P450 i szereg reakcji redoks. Po ponad 150 latach inżynierii metabolicznej produkcja na skalę przemysłową została oddana Sanofi, która produkuje 35-60 ton artemisininy rocznie. Projekt przekształcił globalne zaopatrzenie w artemisininę, demonstrując, że biologia syntetyczna może rozwiązywać problemy z dostępnością leków na niedoleczone choroby i przyniosło Keaslingemu wiele nagród, katalizując kolejne programy biosyntezy inżynieryjnej dla innych antymalarycznych i przeciwnowotorycznych leków.

Przykład 2: Produkcja Szybek Spodnich Szybka dragline'owa pająka jest silniejsza niż stal, a jej wytrzymałość większa od Kevlaru w stosunku do masy, jednak pająki nie da się hodować (terytorialne, drapieżne). Biologia syntetyczna przeniosła geny kodujące białko szyjki spadkowej (MaSp1, MaSp2 z pająków Nephila) na owce, ślimaki mure, *E. coli* i drożdże w celu produkcji białek szyjek. Pioneer Biotech/Bolt Threads i Spiber produkują inżynieroowane białka szyjek w drożdżach na skalę komercyjną, wytwarzając z nich włókna o regulowanym kształcie. AMSilk w Niemczech produkuje białka szyjek w *E. coli* do powłok medycznych i kosmetycznych. Zastosowania obejmują od luksusowych tkanin po szwy chirurgiczne, podpory inżynierowane tkankowo oraz materiały odporne na uderzenia.

Przykład 3: Editory Bazowe CRISPR Technologia edycji bazowa Davida Liu tworzy pojedyncze zmiany nukleotydów bez pętli podwójnego łańcucha DNA. Edytory cytosynowe (CBE) deaminują cytosinę do uracylu (czytany jako tymin) w oknie edycyjnym o długości 4-8 par zasad, wykorzystując nCas9 z nickase połączoną z enzymem deaminazującym. Edytory adeniny przekształcają adeninę w inozynę (czytana jako guanin). Razem konwersje C-do-T i A-do-G obejmują około 30% znanych mutacji punktowych powodujących choroby. Prime editing (2019) rozszerza to na wszystkie 12 możliwych typów substytucji, małe wstawienia i usunięcia, a także zmiany w sekwencji. Kliniczne badania wykorzystujące edytory bazowe do korygowania mutacji powodujących siklamię, warianty PCSK9 i integrację HBV są prowadzone – niezwykła precyzja edycji genomu umożliwiona dzięki inżynierii białek.

Przykład 4: Terapeutyka Komórkowa Programowalna Podchodów typu SYNTHECON inżynieruje T-komórki z złożonymi obwodami decyzyjnymi łączącymi ekspresję CAR, domeny współczynnikowe, geny śmierci i bramki logiczne. 'SYNC' komórki wyrażają dwa CAR (dla dwóch antygenów) z bramą AND – zabijają tylko komórki wyrażające oba, zmniejszając uszkodzenia zdrowych tkanek. SynNotch obwody aktywują ekspresję genów tylko wtedy, gdy receptor wiąże się ze specyficznym ligandem, umożliwiając czujność i reakcję na kombinacje antygenów charakterystyczne dla komórek nowotworowych. Wyłączniki śmierci wykorzystujące RQR8 (rytyksynę-wrażliwy tag CD20-podobny na inżynieroowane komórki) umożliwiają szybkie eliminowanie terapeutycznych komórek w przypadku wystąpienia toksyczności. Te programowalne cechy bezpieczeństwa i specyficzności pozwalają CAR-T-komórkom zwalczać guzy płucne o wyższej różnorodności celów.

Przykład 5: Biokonteneryzacja Uwolnienie genetycznie zmodyfikowanych organizmów do środowiska wymaga strategii kontrolowania, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się w środowisku. Biokonteneryzacja polega na ewolucjonowaniu organizmów wymagających nieznanych aminokwasów (UA) wprowadzonych w strategicznych miejscach genów – organizmy umierają bez syntetycznie wytworzonych UA w ich pożywieniu. Autotrofia dla syntetycznych związków niedostępnych w naturze zapobiega replikacji poza wyznaczonymi środowiskami. Bakterie MAGE z Harvarda mają wszystkie 321 stopowody TAG przypisane do wprowadzania UA – genom o długości 3,8 Mb zastępujący organizmowy zapewnia solidne biokonteneryzację przy jednoczesnym udowodnieniu możliwości rozszerzenia kodu genetycznego na poziomie organizmu. Regulacyjne ramy dla uwolnień środowiskowych kontrolowanych syntetycznych organizmów ewoluują w miarę postępu zastosowań gene drive i inżynierii środowiska.

Przykład 6: Biologia Syntetyczna Bez Komórek Systemy biologii syntetycznej bez komórek wykorzystują oczyszczone aparaty transkrypcji i translacji poza żyjącymi komórkami do produkcji białek lub wykonywania obwodów genetycznych bez użycia organizmu. System PURE odtworza transkrypcję i translację *E. coli* z 36 oczyszczonych białek i jest bardzo konfigurowalny. Systemy biologii syntetycznej bez komórek umożliwiają szybkie prototypowanie obwodów genetycznych (3-8 godzin w porównaniu z dniami w komórkach), syntezę toksycznych białek, wprowadzanie nienaturalnych aminokwasów bez inżynierii komórek żywych i diagnostykę punktową (SHERLOCK, DETECTR – detekcja kwasu nukleinowego CRISPR-oparty na komórkach bez komórek). Zamarznięte reakcje biologii syntetycznej bez komórek można rehydratować w terenie lub w środowiskach o niskiej zasobności, umożliwiając biosensory przenośne dla chorób zakaźnych, wykrywania zanieczyszczeń i monitoringu bezpieczeństwa żywności.

Przykład 7: Gene Drive Gene drive to systemy biologii syntetycznej, które odchylają dziedziczenie od oczekiwanego w mechanice Mendla (50%) rozprzestrzeniając modyfikacje genetyczne w populacjach dzikich. CRISPR homing drive cięte wildtype allele i kopiują drive allele poprzez HDR, osiągając >90% dziedziczenia. Zaprojektowane zastosowania: rozprzestrzenianie się genów odpornych na malarię w populacjach *Anopheles* moskitów; tłumienie populacji wiewiórek inwazyjnych na obszarach ochrony wysp; redukcja zdolności przenoszenia Dengue/Zika przez *Aedes aegypti*. Ryzyko ekologiczne, rozprzestrzenianie się graniczne, możliwość odwrócenia i ramy prawne są kluczowe; daisy-chain drive (wymagające kilku elementów genetycznych tylko w zmodyfikowanych populacjach do utrzymania) i drive regionalne (ograniczone do izolowanych populacji) są opracowywane jako architektury łagodzące ryzyko.

Przykład 8: Właściwości Żyjących Materiałów Właściwości żyjących materiałów (ELM) łączą biologię syntetyczną z naukami materiałowymi, aby tworzyć materiały, które rosną, samonaprawiają się, czują otoczenie i ewoluują. Laboratorium Voigt inżynierowało *E. coli* do produkcji białek biofilmowych tworzących struktury nanofibrylane o przewodności elektrycznej lub kontrolowanych właściwościach mechanicznych poprzez programowanie genetyczne składu włókien curli. Żyjący beton zawiera fototroficzne bakterie cyjanobakterii w zlepkach piasku; bakterie-mineralizacja wzmacnia kompozyt, a bakterie pozostają żywe i mineralizują pęknięcia. Materiały oparte na szyjce tworzą się z inżynieroowanych komórek, które wykrywają i reagują na wejścia. ELM mogą umożliwić samonaprawiającą się infrastrukturę, urządzenia hybrydowe biologiczno-elektroniczne oraz roboty miękkie napędzane żyjącymi komórkami.

Wypróbuj na żywo

Wszystko powyżej działa w Twojej przeglądarce — otwórz Biologię Syntetyczną: Inżynierię Żyjących Systemów i zmieniaj parametry podczas działania. Nic nie jest instalowane, nic nie jest przesyłane, cały model funkcjonuje w jednym oknie.

Wypróbuj na żywo

Wszystko powyżej działa bezpośrednio w Twojej przeglądarce — otwórz Synthetic Biology: Engineering Living Systems i zmieniaj parametry podczas działania. Nic nie jest instalowane ani przesyłane na serwer, cały model działa w jednej karcie.