Біологію хроматину та тривимірна організація геному

Вступ до біології хроматину

У еукаріотичних клітинах приблизно 2 метри геномної ДНК повинні бути стиснуті в ядрі, діаметром лише 5-10 мікрометрів – це співвідношення стиснення становить приблизно 400 000 до 1. Це пакування досягається завдяки хроматину: ДНК, що обвита навколо октамерів гістонів, утворюючи нуклеосоми, нуклеосоми, складені в вищі рівні структур, і зрештою – хромосомні петлі та домени, організовані в ядрі. Хроматин не є просто рішенням для пакування, а й активною регуляторною системою: положення нуклеосом, модифікації гістонів, комплекси ремішування хроматину та тривимірне укладання разом контролюють, які гени доступні та експресуються в кожному клітинному типі та в кожному контексті.

Епігенетична складність хроматину представляє собою другий рівень генетичної інформації – одна й та сама послідовність ДНК, упакована по-різному, створює більше 200 різних клітинних типів, що складають людський організм. Порушення регуляторів хроматину викликають розлади розвитку, інтелектуальні порушення та рак. Розуміння біології хроматину є важливим для інтерпретації того, як регуляторні варіанти (некодуючі варіанти GWAS часто впливають на доступність енхансерів) спричиняють генетичні захворювання, як змінюються епігенетичні геноми раку та як відбувається епігенетичне перепрограмування під час розвитку та перепрограмування до iPSC (первинні плюрипотентні клітини), скидає хроматинний стан.

Структура хроматину

Біологію нуклеосомів

Нуклеосоми складаються з ДНК довжиною 147 парів нуклеотидів, що обертається навколо октамера гістонів (по дві копії кожного з H2A, H2B, H3, H4). Октамер гістонів має структурований ядро і гнучкі N-кінцеві хвости, які випростерті від поверхні. Посттрансляційні модифікації гістонових хвостів – ацетилювання, метилювання, фосфорилювання, убіквітинування – додаються ензимами-письменниками, видаляються ензимами-видалецьками, і розпізнаються доменами читача, які залучають комплекси ефекторів. Активні промотори несуть H3K4me3; активні епiстохи H3K4me1 та H3K27ac; активна транскрипція H3K36me3; гетерохроматин H3K9me3; регіони, пригнічені Polycomb, H3K27me3. Ці гістонові мітки разом утворюють код гістонів.

Перемоделювання хроматину

Комплекси перемоделювання хроматину, що залежать від АТФ, використовують зсув нуклеосомів, виселення гістонів або обмін варіантами гістонів для зміни доступності хроматину. Комплекси SWI/SNF (BAF/PBAF) зсувають і виштовхують нуклеосоми, щоб відкрити хроматин у регуляторних елементах. Комплекси ISWI рівномірно розташовують нуклеосоми для регулярної конденсації хроматину. Комплекси CHD виконують різноманітні функції, включаючи пригнічення та збирання нуклеосомів. Комплекс NuRD поєднує активність деацетилази гістонів із перемоделюванням хроматину для транскрипційної пригніченості. Мутації в підрозділах комплексу SWI/SNF (ARID1A, SMARCA4, SMARCB1) зустрічаються у 20% усіх людських ракових захворювань – роблячи комплекс SWI/SNF найпоширенішим регулятором хроматину, що мутує в людському злокачественному новому.

Модифікації гістонів та регуляторні елементи

Посилювачі та промотори

Посилювачі – віддалені регуляторні ДНК послідовності (від кbp до Mbp від їх цільових генів), які стимулюють експресію генів, специфічну для клітинного типу, шляхом зв’язування комбінацій транскрипційних факторів. Активні посилювачі позначені H3K4me1 та H3K27ac, доступні для ATAC-seq та DNase-seq, і транскрибуються для виробництва eRNA посилювачів. Супер-посилювачі – надзвичайно великі (>10 кб) кластери активних посилювачів, які стимулюють транскрипцію генів, що визначають ідентичність клітин та онкогенів (MYC, BCL2), з надзвичайною силою. Підміна посилювача хромосомними перебудовами, які розміщують протоонкогени біля супер-посилювачів, призводить до розвитку раку – спостерігається при медулобілому (GATA3, OTX2), ЛМЛ (IGH-MYC) та інших.

Polycomb та Trithorax

Комплекси Polycomb repressive (PRC1 та PRC2) підтримують стабільне епігенетичне глушіння генів розвитку – включаючи HOX кластери – в невідповідних клітинних лініях. PRC2 пише H3K27me3 (EZH2 каталітичний суб’єкт); H3K27me3 розпізнається PRC1 канонічними білками доменів Polycomb. Комплекси Trithorax (MLL/COMPASS) протидіють Polycomb, відкладаючи H3K4me3 на активних локусах розвитку. Фактори транскрипції NSD1/2 гістондеякітьники відкладають H3K36me2, що позначає активно транскрибовані тіла генів. Двовалентна хроматина – одночасне наявність H3K4me3 та H3K27me3 в регуляторних генах – є характерною для ESC та прогенітів, забезпечуючи швидку активацію після сигналів диференціації. Транслокації гену MLL у інфантильній ЛМЛ створюють злиті онгієни з порушеною активністю активації генів.

Тривимірна організація геному

Hi-C (захплення хромосомних конформацій на рівні цілого геному) виявило, що геноми організовані у ієрархічні 3D структури: A/B комірки (активний/неактивний хроматин, що розділений в ядрі), топологічно пов’язані домени (ТД — самопереплітаючіся хромосомні регіони від 40 кб до 3 Мб, ізольовані CTCF та когезином), та хроматинні петлі. Петлі між регуляторними елементами та генами, що експресуються, утворюються на відстанях по генному ходу; втрата ізоляції ТД (через мутацію або видалення сайту CTCF) призводить до переписування регуляторних елементів в контексті раку та розповсюджених захворювань. Фазове розділення – формування конденсованої фази за допомогою внутрішньорозподільних незв’язаних областей транскрипційних факторів і коактиваторів – може лежати в основі утворення транскрипційних центрів на супер-енхансерах.

Приклади та застосування

Приклад 1: послідовність ATAC-сек – доступність хроматину Послідовність ATAC (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) використовує гіперактивний транспозазний фермент Tn5 для впровадження адаптерів послідовності переважно в дещо відсутні ділянки хроматину (доступні області нуклеосом), що ідентифікує всі активні регуляторні елементи по всьому геному в 500 клітинах. Одноклітинна послідовність ATAC-сек (scATAC-сек) відображає регуляторні елементи в окремих клітинах, дозволяючи ідентифікувати клітиноспецифічні регуляторні програми в складних тканинах та відстежувати зміни регулювання під час диференціювання. Інтеграція з одноклітинною послідовністю RNA-сек (scRNA-сек) поєднує картинг доступності хроматину з експресією генів клітиною за клітиною. Інтерпретація варіантів геному використовується для визначення, чи падає варіант GWAS у доступний хроматин у відповідних клітинних типах, що дозволяє пріоритезувати функціонально активні варіанти для подальшого функціонального дослідження.

Приклад 2: інгібування EZH2 при раку Мутації gain-of-function EZH2 (Y646N/F/H, A682G, A692V) зустрічаються у 20% лімфоми Годжкіна та 7% DLBCL. Ці мутації збільшують каталітичну активність EZH2, викликаючи гіперметилювання H3K27me3, яке пригнічує гени, що протидіють розвитку лімфоми. Tazemetostat (інгібітор EZH2) схвалений FDA для лімфоми Годжкіна з мутаціями EZH2 (показуючи 69% загальної відповіді) та епітеліомаїдного саркому (пуротворні пухлини, що потребують EZH2 для виживання). Інгібування EZH2 викликає диференціювання лейкемічних клітин у моделях лімфоми з перестановкою MLL. Пухлини, дефіцитні SWI/SNF (не мають SMARCB1, SMARCA4), розвивають залежність від EZH2 для виживання – класична синтетична смертність, яку можна використовувати терапевтично.

Приклад 3: порушення меж TAD при вадиках кінцівок Лупіанскі та ін. (2015) показали, що видалення/інверсії в локусі EPHA4 у людей порушують межі TAD, викликаючи перерозподіл міжгенерних-енценерних взаємодій – звичайно активні енценерні гени PAX3 отримували близькість до генів WNT6, IHH або EPHA4, що призводило до ектопічної експресії та відмінних вад кінцівок (полідактия, брахідактилія) в залежності від того, який промотор був «захоплений». Це встановило, що межі TAD є функціонально критичними для запобігання міжгенерним-енценерним взаємодіям і що структурні варіації, які порушують межі, викликають захворювання через регуляторні, а не кодові зміни – важливий механізм інтерпретації складних структурних генетичних варіацій.

Приклад 4: інгібітори доменів бромо Бромодомени (BRD2, BRD3, BRD4) містять бівалентні домени брому, які читають H3K27ac на активних енценерних ділянках, залучаючи P-TEFb для стимуляції розширення RNA Pol II та сприяючи транскрипції онкогенів (MYC, BCL-2, IRF4) на суперенценерних ділянках у ракових клітинах. Інгібітори BRD4 (JQ1, I-BET762, OTX015) непропорційно пригнічують транскрипцію на суперенценерних ділянках порівняно з нормальними енценерними ділянками. У пухлинах з MYC-залежністю (лімфома Буркіта, NMC, мієлома) інгібування BET викликає драматичне пригнічення транскрипції та загибель клітин; проводяться клінічні випробування в гематологічних злоякісних новоутвореннях та NMC (пухлина з яєчника), що демонструють протипухлинну активність; розробляються стратегії комбінованого лікування для подолання механізмів резистентності, включаючи ампліфікацію MYC.

Приклад 5: онкогістоновість H3K27M у DIPG Дифузна внутрішньопотентна глиома (DIPG) – незцілене дитяче мозкове пухлини, має мутації K27M в генах, що кодують варіанти гістону H3 (H3F3A або HIST1H3B) у понад 80% випадків. Онкогістоновий K27M діє як домінуючий-негативний інгібітор PRC2, викликаючи глобальну втрату H3K27me3 та активуючи звичайно пригнічені розвиткові гени. Ця епігенетична катастрофа сприяє утворенню глиоми через змінену диференціацію клітин-предківників нервів. ONC201 (антагоніст DRD2/DRD3) показала неочікувану специфічну активність у H3K27M-мутованій DIPG в клінічних випробуваннях – отримано статус «швидкого доступу» FDA. Розуміння механізму H3K27M призвело до розробки комбінацій ONC201, які зараз перебувають на етапі реєстрації.

Приклад 6: CTCF та когезин при випрощенні циклів Hi-C та дослідження зображень встановили, що хроматинові цикли утворюються за допомогою випрощування циклів: комплекси SMC когेशінного кільця транспортуються вздовж хроматину довантаження та розвантаження ДНК до тих пір, поки вони не блокуються конвергентними сайтами CTCF, утворюючи стабільні цикли Anchor. Мотиви CTCF визначають межі TAD; білок CTCF з 19-залізним пальцем зв’язується з понад 55 000 генетичними сайтами. Видалення когेशінного призводить до негайного припинення меж TAD та більшості циклів ген-енценерів. Мутації когेशінного та CTCF в пухлинах змінюють архітектуру циклів, дозволяючи активацію онкогенів. Розуміння механіки випрощування циклів забезпечує біологічний фреймворк для регулювання генів і пояснює, як інструкції послідовності лінійного ДНК реалізуються як 3D-регуляторна топологія.

Приклад 7: метилювання ДНК та залізо Метилювання ДНК – батьківське-залежна моноаллелічна експресія, підтримувана диференційно метильованими ділянками (DMR), встановленими в гаметтах і підтримуваними в соматичних клітинах. Локус H19/IGF2 – материнський алель має метильовану ICR, яка блокує зв’язування CTCF, дозволяючи енценерним ділянкам активувати IGF2; батьківський алель має неметильоване ICR, де зв’язування CTCF ізолює IGF2 від енценерних ділянок, активуючи РНК-полімеразний транскриптор H19. Синдром Беквіхта-Віедмана виникає внаслідок втрати материнського метилювання, що дозволяє біаллелічну експресію IGF2. Синдром Енгелмана (втрата батьківської UBE3A) і синдром Прадера-Віллі (п’ятий хромосома деліція) демонструють, що метилювання є необхідним для нормального розвитку та нейророзвитку.

Приклад 8: транскрипційні фактори піонера Транскрипційні фактори піонера (наприклад, FoxA, GATA, Oct4) можуть зв’язуватися з закритими гетерохроматичними ділянками ДНК та відкриватимуть хроматин, ініціюючи транскрипцію генів під час диференціації та репрограмування. FoxA1 діє як фактор піонера для зв’язування з активними енценерними ділянками печінки, залучаючи комплекси переструктурування хроматину для відкриття хроматину, що дозволяє подальшому зв’язуванню транскрипційних факторів та транскрипції генів. У пухлинах FoxA1 є фактором піонера для зв’язування з рецептором андрогену в раку простати – мутації FoxA1 в раку простати змінюють специфічність зв’язку, що дозволяє AR-незалежній онкогенній транскрипції. Розуміння біології факторів піонера пояснює переходи між клітинними типами та розкриває механізми транскрипційного репрограмування, які створюють терапевтичні вразливості.

Спробуйте онлайн

Все вище працює у вашому браузері — відкрийте «Хроматин та тривимірна організація геному» та змінюйте параметри під час роботи. Не встановлюється нічого, не завантажуються дані, весь модуль існує в одному вікні.

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Chromatin & 3D Genome Organisation і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.