Гель-електрофорез: Як Гель Перетворює Заряд на Розділення за Розміром

Однорідно заряджена молекула, нерівномірна перешкода

ДНК-фосфатна матриця несе негативний заряд, який є практично однорідним на одиницю довжини — фрагмент з 500 основ має майже вдвічі більший заряд і масу, ніж фрагмент з 250 основ, що означає, що співвідношення заряду до маси майже не змінюється залежно від розміру. У вільному розчині під дією електричного поля це призвело б до того, що всі фрагменти ДНК рухалися б приблизно однаковою швидкістю, що було б марним для визначення їхнього розміру. Гель-електрофорез вирішує цю проблему, змушуючи ДНК проходити крізь ситоподібну матрицю — пористий гель, зазвичай агароз або поліакриламід, де розмір, а не заряд, стає тим, що обмежує швидкість.

Два режиму просіювання: Оґстон та рептиція

Для невеликих та середніх фрагментів, що рухаються крізь гель, чия пори порівняно або більші за молекулу, застосовується модель Оґстона: гель поводиться як випадковий сито, і більша, більш сферична молекула має меншу кількість доступних шляхів через пори, тому рухливість падає приблизно залежно від розміру молекули відносно середнього розміру пор. Для великих фрагментів ДНК (зазвичай більше 1-2 кбіт у типовому агарозному гелі), ДНК більша за пори гелю і повинна звиватися головою вперед через сітку в видовженій, черв’якоподібній конфігурації – це режим, що називається рептицією (від латинського ‘to creep’, ‘повзати’). У режимі рептиції залежність між рухливістю та розміром молекули стає більш плавною, тому дуже великі фрагменти стають прогресивніше важко розрізнити на стандартному гелі, і тому існують методики, як-от гель-електрофорез з імпульсним полем, для розділення хромосомних фрагментів шляхом періодичного перемикання напрямку поля.

Калібрувальна крива: перетворення відстані на розмір

У межах режиму, коли гель дійсно розрізняє фрагменти, рухливість пов’язана з розміром фрагментів у формі, яка приблизно лінійно-логарифмічна протягом корисного діапазону:

відстань міграції ~ логарифм 10 (довжина фрагменту в базових одиницях) // приблизно, в межах діапазону розрішення гелю Це пояснює, чому кожен гель запускається з ДНК-сходинки — смужка, завантажена фрагментами відомих стандартних розмірів — поряд із невідомими зразками. Побудова кривої калібрування, де відомі розміри сходинки (на логарифмічній шкалі) проти відстані міграції, дає калібрувальну криву; читання відстані міграції невідомого зразка з тієї ж кривої, запущеної за однакових умов у тому ж гелі, дає його оцінений розмір. Калібровка дійсний лише в межах, охоплених сходинкою, і лише для фрагментів приблизно однакової форми (лінійне ДНК поводиться інакше, ніж замкнену плазмідну ДНК однакового розміру, оскільки форма впливає на те, як молекула проходить через сітку).

Важливо пам’ятати, що точність оцінки залежить від того, наскільки добре сходинка відповідає фрагментам у вашому зразку. Використання ДНК-сходинки є ключовим кроком у гель-електрофорезі, дозволяючи точно визначити розмір невідомих фрагментів ДНК.

distance migrated ~ log10(fragment length in base pairs)     // approximately, over the gel's resolving range

Чому важлива концентрація гелю

Більший відсоток агарози в гелі забезпечує менші середні розміри пор, що краще розділяє малі фрагменти, але робить великі фрагменти повільно ковзати, майже не розділяючись; нижчий відсоток гелю має більші пори, добре розділяючи великі фрагменти, але дозволяє маленьким фрагментам збігатися біля переднього краю барвника. Вибір відсотка концентрації гелю визначає діапазон розмірів фрагментів, між якими ви хочете, щоб ефект сита відрізнявся – типовий загальний гель агарози має концентрацію 0,7–2%, з нижнім кінцем для великих фрагментів (десятки кілобайт) і верхнім кінцем для малих (менше кількох сотень нанометрів).

Електрофорез з використанням SDS: примушування білків дотримуватися однієї правил

Білки не мають зручного рівномірного заряду на одиницю довжини, як у ДНК, оскільки їхній природний заряд залежить від конкретної послідовності амінокислот та складності згортання. Тому білкові молекули дуже сильно варіюються за формою при однаковій масі. SDS-електрофорез (електрофорез у поліакриلامіді з додаванням натрію додецилсульфату) одночасно вирішує обидві ці проблеми: SDS є аніонним мийцем, який покриває денатуруваний, розгорнутий білок приблизно пропорційно його довжині, маскуючи природний заряд білка сильно негативним зарядом, пропорційним розміру, і денатурація усуває варіації форми. В результаті SDS-електрофорез, як і електрофорез ДНК в гелі, сортує переважно за розміром (молекулярною масою), а не за природним зарядом або формою – той самий трюк з ситанням та рівномірним зарядом, застосований до іншої молекули.

Frequently asked questions

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Gel Electrophoresis і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.