Elektroforeza na Gele: Jak Gel Przekształca Ładunek w Sortowanie Rozmiarowe

Jednorodzenie naładowanej cząsteczki, nierówny labirynt przeszkód

Rdzeń DNA z fosforanem przenosi ładunek ujemny, który zasadniczo jest jednolity wzdłuż jednostki długości – fragment o 500 parach bazowych ma prawie dokładnie podwójne pole siły i masę oraz dwa razy większy rozmiar niż fragment o 250 parach bazowych, co oznacza, że współczynnik ładunku do masy zmienia się niewiele wraz ze zmianą wielkości. W swobodnym roztworze pod wpływem pola elektrycznego wszystkie fragmenty DNA poruszałyby się niemal z tą samą prędkością, co byłoby bezużyteczne do określania ich rozmiaru. Elektforezy rozwiązuje to, zmuszając DNA do przemieszczania się przez matrycę sitową – żel o porowatej strukturze, zwykle agarozowy lub poliakrylowy – gdzie wielkość, a nie ładunek, staje się czynnikiem ograniczającym prędkość.

Dwa tryby przesiewania: Ogston i reptacja

Dla małych do średnich fragmentów poruszających się przez żel, którego rozmiar porów jest porównywalny z lub większy niż cząsteczka, obowiązuje model Ogstona: żel zachowuje się jak losowy sitko, a większa, bardziej okrągła cząsteczka ma po prostu mniej dostępnych ścieżek porowych, co powoduje, że mobilność spada w przybliżeniu proporcjonalnie do wielkości cząsteczki w stosunku do średniego rozmiaru pora. Dla większych fragmentów DNA (zazwyczaj powyżej 1-2 kb na typowym żelu agarozowym), DNA jest większe niż pory żelu i musi się przeciągać z głowy przez siatkę w wydłużonej, nicirepi kształcie – tryb nazywany reptacją (z łac. 'żebrak', czyli 'ślizgać się'), zapożyczony z fizyki polimerów. W trybie reptacji zależność między mobilnością a rozmiarem cząsteczki wygładza się, dlatego bardzo duże fragmenty stają się progresywnie trudniejsze do rozróżnienia na standardowym żelu i dlatego istnieją techniki takie jak elektroforeza z polem impulsowym, aby oddzielać DNA o rozmiarze chromosomu poprzez okresowe przełączanie kierunku pola.

Kalibrująca krzywa: przekształcanie odległości w rozmiar

W obszarze, w którym żel skutecznie rozdziela fragmenty DNA, mobilność koreluje z rozmiarem fragmentu w sposób zbliżony do liniowo-logarytmicznego dla przydatnego zakresu:

odległość migracji ≈ log10(długość fragmentu w parach bazowych) // przybliżone, w zakresie rozdzielczym żelu Dlatego też każdy żel jest uruchamiany z dąbrzyka DNA – pasa obciążonego fragmentami o znanych, standardowych rozmiarach – obok próbek nieznanych. Wykreslanie znanych rozmiarów dąbrzyka (w skali logarytmicznej) w odniesieniu do odległości migracji daje krzywą kalibracyjną; odczytanie odległości migracji próbki nieznanej z tej samej krzywej, uruchomionej w identycznych warunkach na tym samym żelu, pozwala oszacować jej rozmiar. Kalibracja obowiązuje tylko w zakresie pokrywanym przez dąbrzyek i dotyczy fragmentów o zbliżonym kształcie (liniowy, podwójnie niciowany DNA zachowuje się inaczej niż okrągły DNA plazmid o tej samej długości, ponieważ kształt wpływa na sposób przemieszczania się cząsteczki przez siatkę).

distance migrated ~ log10(fragment length in base pairs)     // approximately, over the gel's resolving range

Dlaczego istotna jest koncentracja żelu

Wyższa koncentracja żelu agarozowego powoduje mniejsze średnie rozmiary por, co lepiej rozdziela małe fragmenty. Jednakże, przy wyższej koncentracji, duże fragmenty poruszają się tak wolno, że prawie w ogóle nie oddzielają się od siebie. Niższa koncentracja żelu daje większe pory, które dobrze rozdzielają duże fragmenty, ale pozwalają małym fragmentom przesuwać się razem w pobliżu frontu barwnego. Wybór procentu żelu to wybór zakresu rozmiarowego fragmentów, pomiędzy którymi oczekiwany jest efekt krystalizacji – typowy, uniwersalny żel agarozowy ma stężenie 0,7-2%, z mniejszymi wartościami dla dużych fragmentów (dziesiątki kb) i większymi dla małych (poniżej kilku set bp).

SDS-PAGE: zmuszanie białek do przestrzegania tej samej reguły

Białka nie posiadają wygodnego jednolitego ładunku na jednostkę długości, jak DNA, ponieważ ich natywny ładunek zależy od konkretnej sekwencji aminowych i składania się w naturalny stan, co daje różnym białkom bardzo różne kształty przy tej samej masie. SDS-PAGE (elektroforeza poliakrylowa z łukiem sodu dodecylomoczynowym) rozwiązuje oba problemy jednocześnie: SDS jest anionowym detergentem, który pokrywa denaturowane, nieściągnięte białko w przybliżeniu proporcji do jego długości, nadając mu silnie ujemny ładunek proporcjonalny do wielkości i tłumiąc natywny ładunek. W efekcie SDS-PAGE, podobnie jak elektroforeza DNA na żelu, sortuje głównie według rozmiaru (wielkości cząsteczkowej) zamiast według natywnego ładunku lub kształtu – ta sama zasada sitowa plus jednolity ładunek, zastosowana do innej cząsteczki.

Frequently asked questions

Wypróbuj na żywo

Wszystko powyżej działa bezpośrednio w Twojej przeglądarce — otwórz Gel Electrophoresis i zmieniaj parametry podczas działania. Nic nie jest instalowane ani przesyłane na serwer, cały model działa w jednej karcie.