Хроматографія колон: перемога коефіцієнту поділу

Перегони, вирішені тим, куди молекулі «хочуть» потрапити

Хроматографія розділяє суміш, використовуючи той факт, що різні сполуки мають різні переваги щодо двох фаз, які контактують: стаціонарної фази, упакованої в колонку (силікагель, оксид алюмінію, з'єднаний органічний плівку) та рухомої фази, яка проходить через неї (розчинник або носій газ у газовій хроматографії). Кожна молекула постійно перебуває в рівновазі між прилипанням до стаціонарної фази та переміщенням з рухомою фазою. Сполука, яка віддає перевагу стаціонарній фазі, проводить більше часу прикріпленою і рухається повільніше; сполука, яка віддає перевагу рухомій фазі, швидко витягується разом. Якщо провести суміш достатньо довго, початково однакові позиції розділяються на чіткі, просторово розмежовані смуги.

Роздільний коефіцієнт

Уподобання визначається кількісно роздільним коефіцієнтом K, який є рівноважним співвідношенням концентрації сполуки в стаціонарній фазі до її концентрації в рушійній фазі:

K = C_стаціонарна / C_рушійна Високий K означає, що сполука сильно утримується та елююється пізніше; низький K означає, що вона мало взаємодіє зі стаціонарною фазою і елююється рано, близько до часу порожнього пробігу t0 (часу, необхідного незміненій рушійній фазі для проходження через колону). Фактор утримання k' (іноді записується k, що не пов’язане з K незважаючи на схожість літер) є тим, що вимірюється з хроматограми – додатковий час, який сполука проводить відносно t0:

K = C_stationary / C_mobile

Чому смуги загострюються у вигляді піків: теорія пластин

Для прогнозування форми піку колонка моделюється як стовп з багатьох дискретних теоретичних пластин – уявних стабільних етапів рівноваги, взяті безпосередньо з дистиляційної теорії. На кожній пластині сполучна речовина перемикається між двома фазами; чи більше пластин, то більше етапів повторного досягнення рівноваги, що робить пік елюючого компонента більш чітким і покращує здатність колони розрізняти подібні сполуки. Рівняння Ван-дер-Ейтера пов’язує висоту пластин H (де менша H означає більш ефективну колонку) із швидкістю потоку рухомої фази u:

H = A + B/u + C*u
// A: eddy diffusion (packing irregularity, flow path variability)
// B: longitudinal molecular diffusion along the column axis
// C: mass-transfer resistance between the two phases
// H has a minimum at an intermediate u — too slow lets diffusion blur bands,
// too fast doesn't give the compound time to equilibrate

Роздільність: наскільки далеко - це достатньо?

Два піки, близькі за часом утримання, але широкі, можуть злитися в один масив; два піки, що знаходяться далеко одна від одної, але гострі, будуть відокремлені чітко. Роздільність Rs поєднує обидва ці ефекти – різницю між часами утримання відносно середньої ширини піку, і є фактичним показником, який оптимізують хроматографи, а не лише час утримання:

Rs = 2 * (tR2 - tR1) / (w1 + w2) w1, w2: ширина базових піків Роздільність 1.5 є традиційним порогом для "відмежованих на базі" піків – тобто відсутності перекриття між двома піками. Покращення роздільної здатності означає або збільшення різниці в часах утримання (зміна хімії стаціонарної фази або полярості рухомої фази, щоб змінити K для однієї речовини відносно іншої), або звуження піків самих по собі (довша колонка, менший розмір частинок або оптимальний витратний коефіцієнт біля мінімуму ван-Демтера).

Rs = 2 * (tR2 - tR1) / (w1 + w2)     // w1, w2: baseline peak widths

Порядок елюції визначається хімією, а не розміром

Часто зустрічається помилкове уявлення, що хроматографія сортує за молекулярним розміром подібно до сита. Колоноча хроматографія сортує за прихильністю – наскільки хімічні властивості сполуки відповідають стаціонарній фазі порівняно з рухомою фазою. У нормальній колоночній хроматографії на основі кремнезему (нормальна фаза) більш полярні сполуки сильніше зв’язуються з полярною стаціонарною фазою і елююються пізніше; у зворотній фазі (неполярна пов'язана фаза з полярною рухомою фазою, яка є стандартною в більшості сучасних HPLC), порядок перевертається і більш полярні сполуки елююються першими. Розмір має значення лише опосередковано, через те, як він впливає на дифузію та площу поверхні взаємодії – сортувальною змінною завжди є коефіцієнт розподілу.

Frequently asked questions

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Column Chromatography і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.