Chromatografia Kolumnowa: Wyścig Zdecydowany Współczynnikiem Podziału

Wyścig decydowany o to, gdzie cząsteczka wolałaby się znajdować

Chromatografia oddziela mieszaninę, wykorzystując fakt, że różne związki mają różne preferencje dla dwóch faz w kontakcie: fazy stałej wsypanej do kolumny (siarka, alunina, połączony film organiczny) i fazy ruchomej przepływającej przez nią (roztwór lub gaz nośny w chromatografii gazowej). Każda cząsteczka stale równoważy między przyleganiem do fazy stałej a podróżowaniem z faza ruchomą. Związek, który preferuje fazę stałą, spędza tam więcej czasu i porusza się wolniej; związek, który preferuje fazę ruchomą, jest szybko odrywany. Uruchom mieszaninę wystarczająco długo i początkowo identyczne pozycje wyjściowe rozdzielają się w wyraźne, przestrzennie rozróżnione pasma.

Współczynnik podziału

Preferencja jest ilościowo określana przez współczynnik podziału K, czyli stosunek stężenia związku w fazie nieruchomej do jego stężenia w fazie ruchomej w stanie równowagi:

K = C_nieruchoma / C_ruchoma Wysokie K oznacza, że związek jest mocno zatrzymywany i eliżuje późno; niskie K oznacza, że słabo oddziałuje z fazą nieruchomą i eliżuje wcześnie, blisko czasu pustego t0 (czasu potrzebnego do przejścia samego niezatrzymanej fazy ruchomej). Czynnikiem retencji k' (czasami zapisywany jako k, niezależny od K pomimo podobnej litery) jest to, co faktycznie mierzy się z chromatogramu – różnicy w czasie pomiędzy związkiem a t0:

K = C_stationary / C_mobile

Dlaczego pasma wyostrzają się w szczyty: teoria płyt

Kolumna jest modelowana, aby przewidywać kształt szczytu, jako stos z wielu dyskretnych teoretycznych płyt – wyimaginowanych etapów równowagi, bezpośrednio zapożyczonych z teorii destylacji. Na każdej płycie związek odzyskuje równowagę między dwiema fazami; im więcej płyt, tym precyzyjniejsze i częstsze kroki reabsorpcji, co wyostrza pasmo elucji i poprawia zdolność kolumny do rozróżnienia podobnych związków. Równanie van Deemtera wiąże wysokość płyty H (im mniejsza H, tym bardziej wydajna kolumna) z prędkością przepływu fazy nośnej u:

H = A + B/u + C*u
// A: eddy diffusion (packing irregularity, flow path variability)
// B: longitudinal molecular diffusion along the column axis
// C: mass-transfer resistance between the two phases
// H has a minimum at an intermediate u — too slow lets diffusion blur bands,
// too fast doesn't give the compound time to equilibrate

Rozdzielczość: jak daleko jest wystarczająco daleko

Dwa szczyty, które są blisko siebie pod względem czasu retencji, ale szerokie, zleją się w jedną masę; dwa szczyty oddalone od siebie, ale ostre, oddzielą się czysto. Rozdzielczość Rs łączy oba te efekty – różnicę w czasie retencji w stosunku do średniej szerokości szczytu – i jest rzeczywistym metrykiem, który optymalizują chromatografowie, a nie tylko czas retencji:

Rs = 2 * (tRt2 - tR1) / (w1 + w2) w1, w2: szerokości szczytu na tle bazowym Rozdzielczość równa 1,5 jest konwencjonalnym progiem dla "oddzielonych na tle bazowym" szczytów – co zasadniczo oznacza brak nakładania się między nimi. Poprawa rozdzielczości oznacza albo oddalenie czasów retencji (zmiana chemii fazy stałej lub polarności fazy mobilnej, aby przesunąć K dla jednego związku względem drugiego) albo zawężenie szczytów (dłuższa kolumna, mniejszy rozmiar cząstek lub optymalna prędkość przepływu w pobliżu minimum Van Deemtera).

Rs = 2 * (tR2 - tR1) / (w1 + w2)     // w1, w2: baseline peak widths

Kolejność eluowania zależy od chemii, a nie od wielkości

Często popełniany błąd polega na założeniu, że chromatografia sortuje substancje według wielkości molekularnej w sposób zbliżony do działania sitka. Chromatografia kolumnowa opiera się na afińności – czyli na stopniu zgodności chemicznej związku z fazą nieruchomą w porównaniu z fazą ruchomą. W chromatografii normalno-płaszczyznowej na krzemieniu silikonowym, bardziej polarnym związkami wiążą się silniej z polarną fazą nieruchomą i elutują później; w chromatografii obrazkowej (niepolarny, związany krzemień z polarną fazą ruchomą, domyślna w większości nowoczesnych HPLC), kolejność odwraca się i bardziej polarne związki elutują jako pierwsze. Wielkość ma wpływ jedynie pośredni, poprzez wpływ na dyfuzję i powierzchnię kontaktu – sortującym czynnikiem jest zawsze współczynnik podziału.

Często zadawane pytania

Wypróbuj na żywo

Wszystko powyżej działa bezpośrednio w Twojej przeglądarce — otwórz Column Chromatography i zmieniaj parametry podczas działania. Nic nie jest instalowane ani przesyłane na serwer, cały model działa w jednej karcie.