Протеоміка: Характеризація Повного Протеїнового Складу

Вступ до протеоміки

Протеоміка – це масштабне вивчення білків, включаючи їх ідентифікацію, кількість, модифікації, взаємодії, структури та функції, на глобальному рівні. Гендомія надає статичний генетичний план, тоді як протеоми динамічні: вони відрізняються між клітинними типами, стадіями розвитку та фізіологічними та патологічними умовами; формуються модифікаціями після перетворення (фосфорилювання, убіквітинування, ацетилювання, глікозилювання), які значно змінюють функцію білків; і рівні білків корелюють лише приблизно з рівнями мРНК через відмінності в регуляції трансляції та стабільності білків. Протеоми є таким чином функціональним виконавцем клітинних процесів, що робить їх біологічно та клінічно важливими для характеристики.

Сучасна протеоміка базується на технології мас-спектрометрії (МС) – особливо високорозрядному рідинному хроматографічному-тандемному МС (Хроматографія-МС/МС), яка може ідентифікувати та кількісно визначати тисячі білків з складних сумішей. Біоінформатний пошук баз даних узгоджує експериментальні мас-спектри з теоретично прогнозованими масами фрагментів пептидів. Одне Хроматографія-МС/МС експерименту може кількісно визначити понад 10 000 білків у клітинному лізаті; чутливість продовжує покращуватися до протеоміки на рівні окремих клітин; структурна протеоміка – картинг тривимірних структур білків на рівні протеому за допомогою крио-ЕМ та інтерпретації, що підкріплена AlphaFold, додає інформацію про конформацію до даних про кількість.

Мас-спектрометрія в протеоміці

Шутґун протеоміка

Нижньо-вгору (шутґун) протеоміка перетравлює суміші білків за допомогою трипсину, утворюючи пептиди, розділяє їх за методом зворотно-фазної рідинної хроматографії та аналізує за допомогою мас-спектрометрії другого рівня (MS2). Сканування MS1 вимірює значення m/z пептидів (маси попередників); спектри фрагментації MS2 ідентифікують амінокислотні послідовності. Пошук у базі даних (Mascot, Sequest, MaxQuant) збігає спектри з базами даних білків. Кількісне визначення без міток використовує інтенсивність піків пептидів або кількість спектрів для відносної кількості; стабільне маркування ізотопами (SILAC шляхом включення важких лізину/аргініну в клітинній культурі; TMT хімічне маркування) дозволяє одночасно порівнювати до 18 зразків. Прогрес чутливості забезпечує протеомний аналіз вже з 100-1000 клітин.

Протеоміка після перетворення

Відомо понад 600 типів модифікацій після перетворення (ПМП); фосфорилювання є найбільш вивченим. Фоспротеооміка збагачує фосфопептиди за допомогою металооксидної афінної хроматографії (MOAC) або імунопреципітацією з антитіл до фосфотироніну перед LC-MS/MS. Масштабне фоспротеоомне дослідження виявляє тисячі регульованих сайтів фосфорилювання в умовах порушення сигналізації клітин — мережі кіназ-підторгів, механізм дії ліків та стани активації шляхів. Убіквіноміка використовує антитіла до K-epsilon-GG для збагачення сайтів убіквітинованого білка, що відображають регулювання деградації білків. Протеоміка може емпірично характеризувати динамічний ландшафт ПМП на рівні, який неможливо досягти за допомогою підходів, орієнтованих на кандидатів.

Клінічна Протеоміка

Виявлення біомаркерів

Протеоміка на основі мас (MS) дозволяє більш комплексно виявляти захворювальні біомаркери, ніж аналітичні мікромаси, оскільки вона не упереджена та здатна виявити неочікувані білки. Проект «Людина — протеом» систематично вимірював експресію білків у 44 людських тканинах і клітинних лініях за допомогою імуногістохімії та транскриптоміки – визначаючи специфічні для тканин білки та біомаркери раку. Протеоміка плазми з використанням аналізу близькості (Olink) або SomaScan (на основі аптамерів) кількісно визначає тисячі циркулюючих білків у великих епідеміологічних дослідженнях, виявляючи біомаркери захворювань, білки-мішені для ліків та протеїнові QTL (pQTL) для аналізу Mendelian randomisation. Методи на основі близькості дозволяють кількісно визначати понад 7000 білків з мікролітрами плазми в популяційному масштабі.

Протеоміка раку

Консорціум NCI Cancer Proteogenomics (CPTAC) проводив комплексну протеоміку наборів даних TCGA, доповнюючи геномні дані даними про відносний вміст та фосфорилювання білків. Ключові висновки: багато високоекспресованих генів-драйверів раку демонструють збільшення білкового рівня, незалежне від числа копій ДНК через компенсаторні механізми; фосфоропротеоміка ідентифікує активні шляхи кіназ, що забезпечують цільові об’єкти для лікування, незалежні від мутацій; кластери експресії білків розкривають функціональні підтипи пухлин, ортогональні до mRNA-підтипів. Порівняння транскриптоміки з протеомікою в масштабі виявляє посттранскрипційний регуляторний патерн – певні раки знижують експресію певних білків відносно їхнього mRNA через регулювання перекладу.

Структурна та взаємодіюча протеоміка

Перехресне зшивання мас-спектрометрія (ПЗМС) ковалентно зв’язує лізинові залишки, розташовані поруч у білкових комплексах, забезпечуючи просторові обмеження для моделювання структури. Взаємодіюча протеоміка використовує реактивні хімічні зонди для картирування сайтів зв’язування білок-ліганд (активність-орієнтоване профілювання білків, АОПБ)—виявлення всіх білків у протеомі, що зв’язуються з певною хімічною групою. Ідентифікація мішеней ліків для фенотипічно активних сполук використовує теплове профілювання протеому (ТПП)—вимірювання змін стабільності протеому в цілому при зв’язуванні з ліками в цілісних клітинах. Маркування на основі близькості (BioID, TurboID) за допомогою біотинілази, поєднаної з білковим мішенню, біотинілює сусідні білки в живих клітинах, захоплюючи тимчасові взаємодії між білками in situ, неможливі за допомогою традиційних підходів до витягування.

Приклади та Застосування

Приклад 1: Протеом Людини – проєкт «Хітопротеїн» Два дослідження, опубліковані у 2014 році, представили проєктні карти людського протеому (Проєкт «Хітопротеїн»). Об’єднані дані з тканин і клітинних ліній впевнено ідентифікували білки більше ніж з 17 тисяч із приблизно 20 тисяч кодуючих генів – досягнувши 84% покриття на основі генів. Близько 193 білків не мали жодних даних MS, що може свідчити про те, що вони можуть бути не експресовані або були нижче виявлення. Ці посилання забезпечують можливість порівняння між дослідженнями, валідацію біомаркерів та систематичне заповнення прогалин до повного протеому. Ініціатива «Хітопротеїн» з орієнтацією на хромосоми гарантує всебічний захист від білкових продуктів кожної хромосоми за допомогою ортогональних типів доказів. Приклад 2: Фосфопротеоміка та Механізми Діяльності Ліків Фосфопротеоміка після лікування іматинібом (інгібітором BCR-ABL) клітин CML виявила сотні пригнічених фосфатильних сайтів у багатьох сигнальних шляхах, що знаходяться внизу від BCR-ABL, підтверджуючи цільову інактивацію та розкриваючи несподівані позацільові ефекти на інші кінази. Важливо, що фосфопротеоміка виявила компенсаторну активацію шляхів у резистентних клітинах (активація сімейства Src забезпечує альтернативні сигнальні процеси виживання), що допомагає розробляти комбіновані терапії з дасатінібом. Така глобальна фосфопротеомічна характеристика лікованих клітин регулярно використовується у фармацевтичній галузі для розуміння механізму дії та механізмів резистентності системно. Приклад 3: Протеоміка Одиничних Клітин Протеоміка одиничних клітин виникає з методів SCoPE-MS (одиничні клітинні протеоміки за допомогою MS) та подібних методів, які використовують множинну тандемно-масову мітку для маркування окремих клітин. Поточні методи кількісно визначають 1000–2000 білків на одній клітині – значно менше, ніж одноклітинний РНК-секвенування, але забезпечує прямий вимір білків. Технологія швидко розвивається завдяки використанню підготовку з ніанових желець, покращеної LC чутливості та швидших циклів MS. Протеоміка одиничних клітин може ідентифікувати білковий розріз клітинних типів, який не видно за транскриптомікою через посттрансляційне регулювання та виявляти протеомові стани конкретних рідкісних клітинних популяцій, таких як циркулюючі пухлинні клітини з крові пацієнта. Приклад 4: Протеоміка у Відкритті Ліків Кількісна протеоміка є стандартною в фармацевтичному відкритті ліків – фенотипові скритингові результати характеризуються тепловим протеомічним профілюванням для ідентифікації всіх білкових цілей в незмінних клітинах; лідируючі сполуки профілюються проти всього протеому (селективна протеоміка) для виявлення позацільових недоліків; механізм дії встановлюється за допомогою фосфопротеоміки. ABPP конкурентне профілювання з фенотиповими результатами ідентифікує конкретну ферментну кишеню шляхом конкуренції з відомими активними зондами. Ці підходи трансформують відкриття ліків від одноцільового гіпотетичного тестування до незбалансованого протеомо-широкого виявлення цілей та селективного профілювання на невизначених масштабах. Приклад 5: AlphaFold і Структурна Протеоміка AlphaFold2 прогнозує точні тривимірні структури білків з послідовності для практично всього протеому будь-якої організми. База даних AlphaFold містить передбачені структури для майже всіх білків UniProt (~200 мільйонів). Ці структурні прогнози дозволяють раціональний дизайн ліків для непіддатливих білків шляхом ідентифікації прихованих лігандових кишень, допомагають інтерпретувати мінливість амінокислот (чи знаходиться уражений замінник у функціональному сайті?) та дозволяють моделювання взаємодії між білками (AlphaFold-Multimer). Поєднання структур AlphaFold з експериментальними даними MS-закреплених перехресних зв’язків і картами крио-ЕМ створює інтегровані моделі білкових комплексів – протеоміка в масштабі протеому. Приклад 6: Секреторій та Плазмова Протеоміка Плазмовий протеом містить білки, що виділяються з практично всіх тканин (секреторій), роблячи його мінімально інвазивним вікном у здоров’я та хвороби. Альбумін і імуноглобуліни домінують у плазмі за високою концентрацією, але стратегії деплеції та збагачення дозволяють виявляти білки низької концентрації, що походять із тканин. Великий масштаб плазмової протеоміки в UK Biobank (>50 000 учасників) кількісно визначив 2923 білки, відкривши тисячі білково-хворовинних асоціацій та причинно-наслідкові зв’язки за допомогою pQTL-заснованої рендера Mendelian. Протеомічні годинники старіння прогнозують біологічний вік з плазмових білків, ідентифікуючи механізми старіння та потенційні цілі для анти-старіючої інтервенції на популяційному рівні. Приклад 7: Глікопротеоміка Понад 50% людських білків глікозильовані – N-зв’язуючі або O-зв’язуючі цукри, прикріплені до аспарагіну або серину/гліцину. Глікозилювання значно впливає на згортання білків, стабільність, взаємодію та функцію. Глікопротеоміка збагачує глікопептиди та характеризує як сайт білка, так і структуру гліканів за допомогою MS. Раклове глікозилювання значно відрізняється: гликани типу муцину обрізаються (Tn антиген) у багатьох карциномах; PSA (простатний-специфічний антиген) глікоформи розрізняють рак простати від доброякісної гіпертрофії; збільшення сіалювання сприяє імуносупресії та метастазуванню. Рак-специфічні глікаформні сполуки забезпечують можливості біомаркерів і терапевтичних цілей, використовуючи унікальні глікозиляційні закономірності пухлинних клітин. Приклад 8: Протеоміка у Дослідженнях COVID-19 Протеомний аналіз пацієнтів з COVID-19 та плазми від різних груп тяжкості швидко ідентифікував предиктори тяжкості та механістичні інсайти. Huang et al. 2021 виявили протеомічний підпис, що розрізняє важкий та легкий COVID-19 – підвищений рівень активації комплементу, факторів згортання та APR у важкій хворобі. Вірусні білки SARS-CoV-2 взаємодіють з білками господаря – комплекс NSP7-8-12 полімерази, ORF3a взаємодіє з VPS39, порушуючи лізосомальне переміщення. Протеоміка ідентифікувала закономірності експресії ACE2, цілі для дексаметазону та антитілоблокуючі епітопи, демонструючи швидкість та широту протеоміки у науково-дослідних екстрених ситуаціях.

Спробуйте онлайн

Все вище працює у вашому браузері — відкрийте Proteomics: Mass Spectrometry Protein Identifier і змінюйте параметри під час роботи. Не встановлюється нічого, не завантажуються файли, весь модель знаходиться в одному вікні.

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Proteomics: Mass Spectrometry Protein Identifier і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.