Proteomika: Charakterystyka Pełnego Zbioru Białek

Wprowadzenie do Proteomiki

Proteomika to wieloskalowe badanie białek – ich identyfikację, ilości, modyfikacji, interakcji, struktur i funkcji – na poziomie globalnym. Genomika dostarcza statycznego planu genetycznego, natomiast proteoma jest dynamiczna: różni się między typami komórkowymi, etapami rozwoju oraz stanami fizjologicznymi i patologicznymi; kształtowana jest przez modyfikacje potranslatoalne (fosforylację, ubikwitynację, acetylację, glikosylację) które radykalnie zmieniają funkcję białek; a poziomy białek korelują jedynie w przybliżeniu z poziomami mRNA ze względu na regulację translacyjną i różnice w stabilności białek. Proteoma jest zatem wykonawcą funkcji w procesach komórkowych, co czyni ją biologicznie i klinicznie istotną do charakterystyki.

Nowoczesna proteomika napędzana jest technologią spektrometrii mas (SM) – szczególnie wysokiej rozdzielczości chromatografią cieczowo-gazową z tandemem SM (LC-MS/MS) – która może identyfikować i kwantyfikować tysiące białek z złożonych mieszanin. Wyszukiwanie baz danych bioinformatycznych dopasowuje eksperymentalne spektrum mas do teoretycznie przewidywanych mas fragmentów peptydowych. Jedna analiza LC-MS/MS może kwantyfikować ponad 10 000 białek w wyciągu komórkowym; czułość nadal się poprawia w kierunku proteomiki jednowtórkowej. Proteomika strukturalna – mapowanie trójwymiarowych struktur białek na poziomie proteomy za pomocą kryo-EM i interpretacji wspomaganej przez AlphaFold – dodaje informacje o konformacji do danych dotyczących ilości.

Spektrometry Masowe w Proteomice

Shotgun Proteomika

Bottom-up (shotgun) proteomika polega na trawieniu mieszanin białek z trypsinem, generując peptydy, które następnie oddziela się za pomocą chromatografii cieczowej faz odwracalnej oraz analizuje metodą tandemowego spektrometrii masowej (MS). Skany MS1 mierzą wartości m/z peptydów (masy prekursora), a spektrum fragmentacji MS2 identyfikuje sekwencje aminowe. Przeszukiwanie baz danych (Mascot, Sequest, MaxQuant) dopasowuje spektra do baz danych białek. Kwantyfikacja bez etykietowania (label-free quantification) wykorzystuje intensywności szczytów peptydów lub liczenie spektralne w celu określenia względnej zawartości; stabilne oznaczanie izotopowe (SILAC, poprzez wprowadzanie ciężkiego lisinego/arginowego do hodowli komórkowych; TMT, etykietowanie chemiczne) umożliwia wielokrotne porównywanie do 18 próbek jednocześnie. Postępy w czułości pozwalają na proteomikę ilościową nawet z 100-1000 komórek.

Proteomika Modifikacji Po Przetworzeniu Białek

Znano ponad 600 typów modyfikacji po przetworzeniu białek (PTM), a fosforylacja jest najczęściej badana. Proteomika fosforanowa wzbogaca peptydy fosforanowe za pomocą chromatografii opartej na metalowych tlenkach (MOAC) lub immunoprecypitacją z wykorzystaniem przeciwciał antyfosfotorynowych przed LC-MS/MS. Skala proteomiki fosforanowej identyfikuje tysiące regulowanych miejsc fosforylacji w odpowiedzi na zaburzenia sygnalizacji komórkowej – sieci kinaza-substraty, mechanizm działania leków i stany aktywacji szlaków metabolicznych. Ubiquitinomics wykorzystuje przeciwciała anty-K-epsilon-GG do wzbogacenia miejsc ubikwitynacji, mapując regulację degradacji białek. Proteomika może empirycznie charakteryzować dynamiczny krajobraz PTM na dużą skalę, niedostępną za pomocą podejścia opartego na kandydatach genowych.

Proteomika w kontekście klinicznym

Odkrywanie biomarkerów

Analiza proteomiczna metodą MS odkrywa choroby bardziej kompleksowo niż metody oparte na panelach przeciwciał, ponieważ jest obiektywna i może wykryć nieoczekiwane białka. Projekt Human Protein Atlas systematycznie mierzył ekspresję białek w 44 tkankach i typach komórkowych za pomocą immunochemii i transkryptomiki – identyfikując białka specyficzne dla tkanek i markery nowotworowe. Proteomika plazmy, wykorzystująca reakcję proximity extension assay (Olink) lub SomaScan (oparty na aptamerach), kwantyfikuje tysiące cyrkulujących białek w dużych kohortach epidemiologicznych, identyfikując markery chorobowe, białka-targety leków i białkowe QTLs (pQTLs) do analizy Mendelian randomisation. Metody oparte na bliskości pozwalają na kwantyfikację ponad 7000 białek z mikrolitrów plazmy w skali populacyjnej.

Proteomika nowotworowa

Konsorcjum NCI Cancer Proteogenomics (CPTAC) przeprowadziło kompleksową analizę proteomiczną kohort TCGA, uzupełniając dane genomowe o dane dotyczące ekspresji białek i fosforylacji. Kluczowe wyniki: wiele silnie eksprymowanych genów-czynników kierujących nowotwór wykazuje wzmocnienie białkowe odłączone od liczby kopii DNA z powodu mechanizmów kompensacyjnych; proteomika fosforylacyjna identyfikuje aktywowane szlaki kinazowe, które stanowią cel terapeutyczny niezależny od mutacji; klastry współwyrażania białek ujawniają funkcjonalne podtypy nowotworów ortogonalne do podtypów mRNA. Porównanie transkryptomiki z proteomiką w skali pozwala na odkrycie wzorców regulacyjnych po transkrypcji – niektóre nowotwory redukują ekspresję specyficznych białek w stosunku do ich mRNA poprzez regulację translacyjną.”]} self=

paragraphs

Strukturalna i Interakcyjna Proteomika

Krzyżowe wiązanie masowe (XL-MS) koherentnie łączy położone blisko siebie reszty lizyn w złożeniach białkowych, dostarczając ograniczeń przestrzennych dla modelowania strukturalnego. Proteomika chemiczna wykorzystuje reaktywne sondy chemiczne do mapowania miejsc wiązania białko-ligand (profilowanie aktywności białkowej ABPP) – identyfikując wszystkie białka w proteomie wiążące się z określonym typem chemicznym. Identyfikacja celów terapeutycznych dla fenotypowo aktywnych związków wykorzystuje profilowanie termiczne proteomu (TPP) – mierząc zmiany stabilności proteomu na szeroką skalę po związaniu lekami w nienaruszonych komórkach. Oznaczanie bliskości (BioID, TurboID) przy użyciu fuzji ligazy biocytyny z białkiem-łowcą biocytylizuje blisko położone białka w żywych komórkach, przechwytując tym samym tymczasowe interakcje białkowe in situ, których nie można uchwycić za pomocą konwencjonalnych metod „odciągania”.

Przykłady i Zastosowania

Przykład 1: Mapa Białka Ludzkiego – Projekt HPP (HPP) przedstawia mapy pełnego białka ludzkiego. Połączone dane z tkanek i linii komórkowych zidentyfikowały ponad 17 000 z około 20 000 genów kodujących białka – osiągając 84% pokrycia genowego. Około 193 białek nie miało żadnego dowodu MS, sugerując, że mogą być niedoprowadzane lub były poniżej wykrywalności. Te mapy referencyjne umożliwiają porównanie między badaniami, walidację biomarkerów i systemowe uzupełnianie luk w celu uzyskania kompletnego białka. Inicjatywa chromosomowa HPP zapewnia kompleksowe pokrycie wszystkich produktów białkowych z chromosomu z pomocą ortogonalnych typów dowodów.

Przykład 2: Proteomika Fosforanowa i Mechanizmy Leków

Proteomika fosforanowa po leczeniu imatynibem (inhibitor BCR-ABL) w komórkach nowotworowych przewonął setek zniwelowanych miejsc fosforylacji na wielu szlakach sygnalizacyjnych znajdujących się poniżej BCR-ABL, potwierdzając hamowanie na celu i ujawniając nieoczekiwane skutki uboczne na inne kinazy. Ważnie, proteomika zidentyfikowała aktywację kompensacyjną szlaków w komórkach opornych (aktywacja rodziny Src jako alternatywny sygnał przetrwania) prowadząc do opracowywania terapii kombinacyjnych z dasatinib. Takie globalne charakterystyki proteomiczne stanu fosforylacji komórek leczonych lekami są rutynowo wykorzystywane w rozwoju leków, aby zrozumieć mechanizm działania i mechanizmy oporności systematycznie.

Przykład 3: Proteomika Komórki Pojedynczej

Proteomika pojedynczych komórek wyłania się z metod SCoPE-MS (single cell ProtEomics by MS) i powiązanych z nimi metod, wykorzystujących wielopoświadczone tagi masy tandemowe oznaczające poszczególne komórki. Obecnie metody kwantyfikują 1000–2000 białek na pojedynczą komórkę – znacznie mniej niż pojedyncza sekwencjonowanie RNA, ale dostarczają bezpośredniego pomiaru białka. Technologia szybko się rozwija dzięki przygotowaniu próbek nanowell, poprawioną czułości LC i szybszym cyklom pracy MS. Proteomika pojedynczych komórek może identyfikować zmienność komórkową na poziomie białka niewidoczną w sekwencjonowaniu RNA ze względu na regulację po transkrypcji i ujawnia stany proteomiczne specyficznych, rzadkich populacji komórek, takich jak komórki nowotworowe krążące z krwi pacjenta.

Przykład 4: Proteomika w Odkrywaniu Leków

Kwantyfikowana proteomika jest standardem w odkrywaniu leków farmaceutycznych – wyniki badań przesiewowych oparte na fenotypowych, profilowaniu termicznego białek do identyfikacji wszystkich celów białkowych w intaktywnych komórkach; związki prowadzące są profilowane przeciwko całemu białku (selektywne proteomika) aby zidentyfikować potencjalne skutki uboczne; mechanizm działania jest ustalany przez proteomikę fosforanową. ABPP profile porównawcze z wynikami badań fenotypowych identyfikuje konkretny kieszonkowy enzymowy poprzez konkurencję z znanymi sondami aktywności opartej na działaniu. Te podejścia przekształcają odkrywanie leków z testowania hipotezy pojedynczego celu w nieprzeważające identyfikowanie celów białkowych i profilowanie selektywności na niespotykanie dużą skalę.

Przykład 5: AlphaFold i Proteomika Strukturalna

AlphaFold2 przewiduje dokładne trzywymiarowe struktury białek z sekwencji dla zasadniczo całego proteomu każdego organizmu. Baza danych AlphaFold zawiera przewidywane struktury dla w zasadzie wszystkich białek UniProt (~200 milionów). Te przewidywania struktur umożliwiają racjonalny projekt leków dla wcześniej niedostępnych białek poprzez identyfikowanie ukrytych kieszonek wiązania ligandów, pomagają interpretować warianty zmutowane (czy dotyczy odległy aminokwas w miejscu funkcjonalnym?) i umożliwiają modelowanie interakcji białko-białko (AlphaFold-Multimer). Łączenie struktur AlphaFold ze sprzężeniami MS eksperymentalnymi i mapami krioelektronicznymi tworzy zintegrowane modele strukturalne białek złożonych – proteomika strukturalna na dużą skalę.

Przykład 6: Sekretom i Proteomika Plazma

Plazma proteom zawiera białka wydzielane w zasadzie przez wszystkie tkanki (sekretom) czyniąc ją minimalnie inwazyjnym oknem do zdrowia i choroby. Albumin i immunoglobuliny dominują w plazmie pod względem dużej ilości, ale strategie depopłyniania i wzbogacania umożliwiają wykrywanie białek pochodzących z tkanek o niskiej zawartości. Duża skala proteomiki plazmy w UK Biobank (>50 000 uczestników) kwantyfikowała 2923 białka odkrywając tysiące związków białko-choroba i relacji przyczynowych poprzez pQTL oparte na Mendelian randomizacji. Proteomiczne zegary starzenia przewidują wiek biologiczny z białek plazmy, identyfikując mechanizmy starzenia się i potencjalne cele interwencji przeciwstarzeniowych na poziomie populacyjnym.

Przykład 7: Glycoproteomika

Ponad 50% białek ludzkich jest glikozylowanych – N-związane lub O-związane cukry dołączone do asparaginy lub kwasów treonowych. Glikozylacja głęboko wpływa na składanie, stabilność, interakcje i funkcję białka. Glycoproteomika wzbogaca peptydy glikoproteiny i charakteryzuje zarówno miejsce białkowego jak i strukturę glikanową przez MS. Zmiany w glikozylacji raka są rozległe: glikany typu Tn (Tn antigen) są skracane we wielu karcynomach; PSA (prostate-specific antigen) formy glikowe odróżniają rak prostaty od przerostu bez zmian; zwiększone sialinizacja promuje immunosupresję i metastazy. Specyficzne dla raka formy glikanów dostarczają możliwości biomarkerów i celów terapeutycznych wykorzystujących unikalne wzorce glikozylacji komórek nowotworowych.

Przykład 8: Proteomika w Badaniach nad COVID-19

Analiza proteomiczna pacjentów z COVID-19 i plazmy z różnych grup ciężkości choroby szybko zidentyfikowała predyktory ciężkości i mechanizmy. Huang et al. (2021) zidentyfikowali sygnatury proteomiczne w plazmie rozróżniające ciężkie od łagodnych przypadków COVID-19 – podwyższone białka aktywacji komplementu, czynniki krzepnięcia i APR w ciężkiej chorobie. SARS-CoV-2 zainfekowane komórki proteomiczne ujawniły interakcje białkowe wirusa z gospodarczymi białkami – kompleks NSP7-8-12 polimerazy, ORF3a oddziałujący z VPS39 zakłócający transport lisozomalny. Proteomika zidentyfikowała wzorce ekspresji ACE2, cele dexametazonu i epitopy blokujące przeciwciała, demonstrując szybkość i szerokość proteomiki w badaniach kryzysowych związanych z pandemią.

Wypróbuj na żywo

Wszystko powyżej działa w Twojej przeglądarce — otwórz Proteomika: Masa Spektrometria Identyfikator Białek i zmieniaj parametry podczas działania. Nic nie jest instalowane, nic nie jest przesyłane, cały model znajduje się w jednej zakładce.

Wypróbuj na żywo

Wszystko powyżej działa bezpośrednio w Twojej przeglądarce — otwórz Proteomics: Mass Spectrometry Protein Identifier i zmieniaj parametry podczas działania. Nic nie jest instalowane ani przesyłane na serwer, cały model działa w jednej karcie.