Центрифуги: Використання обертання для змушеного осідання

Обертання замінює очікування

Залишившись наодинці під звичайним тяжінням, частинки різної щільності та розміру в суспензії зрештою осідають — але для малих частинок, таких як кров'яні клітини або комплекси білків, цей природний процес осадження може займати години чи дні. Центрифуга замінює штучне поле, яке може досягати тисяч кратностей (від 1g), що дозволяє прискорити процес осадження з днів до хвилин.

Відносна центрифужна сила

При обертанні зразка під кутовою швидкістю ω на відстані r від осі відбувається прискорення до центру, яке зазвичай позначається як множення земної сили — відносна центрифужна сила (РЦС), також відома як «×g»:

РЦС = ω² . r / g ω = 2.π.N / 60 (N – швидкість обертання ротора в об/хв) Приклад: N = 10 000 об/хв, r = 0,08 м -> ω ~ 1047 рад/с -> РЦС ~ 9300 × g Оскільки РЦС залежить від квадрату швидкості обертання ротора, подвоєння об/хв збільшує силу вчетверо — тому швидкість регулятора центрифуги має значний вплив на час розділення, і використання одного й того ж ротора при 5000 та 15000 об/хв може призвести до різниці між м’яким розділенням плазми та такою силою, яка руйнує клітини.

RCF = omega^2 . r / g          omega = 2.pi.N / 60   (N = rotor speed in rpm)

example: N = 10,000 rpm, r = 0.08 m  ->  omega ~ 1047 rad/s  ->  RCF ~ 9,300 x g

Закон Стокса: як швидко рухається частинка

Частинка не від’єднується миттєво лише тому, що на неї діє сила — вона рухається з термінальною швидкістю, встановленою балансом між цією силою та в'язким опором навколишнього рідини. Для маленького сфери в ламинарному (низькому числі Рейнольдса) потоці закон Стокса дає цю термінальну швидкість осідання, а центрифужний варіант просто замінює гравітацію g локальною відцентровою прискоренням ω²r:

v = d²/ (ρ_p - ρ_f) * ω² * r / 18 * η d = діаметр частинки ρ_p, ρ_f = щільність частинки, рідини η = в'язкість рідини З цього рівняння випливають дві наслідки. Швидкість масштабується з квадратом діаметра, тому частинка вдвічі більша осідає в чотири рази швидше — саме тому диференційне центрифугування розділяє за розміром і щільністю на етапах, обертаючи її короткочасно на низькій швидкості, щоб першим відмити найбільші структури, а потім поступово збільшуючи швидкість та тривалість для вилучення все менших і менших частинок. І частинка, щільність якої точно відповідає щільності навколишньої рідини (ρ_p = ρ_f), має нульову чисту швидкість незалежно від того, наскільки сильно її обертають — основа ізопічної ('рівновід'ної) сепарації.

v = d^2 . (rho_p - rho_f) . omega^2 . r / (18 . eta)

d       = particle diameter
rho_p, rho_f = density of particle, of fluid
eta     = fluid viscosity

Дифференциальная центрифугирование: разделение крови

При однократном отведении образца крови на скорость несколько минут образуется четкое разделение на три видимых слоя, чисто за счет разницы плотностей. Эритроциты, самый плотный компонент, осаждаются внизу. Над ними находится тонкий, бледновато-розовый лейкоцитарный слой (содержит лейкоциты и тромбоциты) со средней плотностью. На вершине плавает соломенно-желтая плазма, наименее плотный компонент, по сути, вода с растворенными белками и сверточными факторами. Этот же принцип последовательных стадий – центрифугирование, отцеживание супернатанта, ресуспендирование осадка и повторное центрифугирование при другой скорости – является стандартным протоколом для выделения всего, начиная от компонентов крови и заканчивая субклеточными органеллами.

Центрифугування за градієнтом щільності: сортування виключно за щільністю

Для більш точного розділення зразки укладаються шарами на попередньо сформований градієнт щільності (зазвичай сахарозу або хлорид цезію, які щільні внизу та розведені вгорі) перед обертанням. При центрифугуванні за зоною швидкості частинки розділяються переважно за розміром і формою, переміщуючись з різною швидкістю через градієнт і пробіг зупиняється до того, як будь-хто досягне рівноваги. При центрифугуванні за ізогінності (рівновазі) пробіг триває до тих пір, поки кожна частинка не припинить переміщення – не опускається в точці градієнта, де щільність навколишньої рідини відповідає її власну – що розділяє виключно за щільністю, незалежно від розміру або форми, і є достатньо точною для розділення ДНК з незначними різницями в щільності, як у класичному експерименті Меселсона-Штайля, який підтвердив семіконсервативне реплікування ДНК.

Часті запитання

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Centrifuge і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.