Centrifugy: Wykorzystanie Obrót do Zmuszenia Osadzania

Wirówka zastępuje czekanie

Pozostawione bez interwencji pod działaniem zwykłej grawitacji, cząstki o różnej gęstości i rozmiarze w zawiesinie z czasem oddzielają się – jednak dla małych cząstek, takich jak krwinki lub kompleksy białkowe, naturalny proces osadzania może trwać godziny lub dni. Wirówka zastępuje działanie 1g Ziemi sztucznym polem, które może osiągać setki tysięcy g, przekształcając proces osadzania, który zajęłby dni, w ten, który trwa jedynie minuty.

Względna siła odśrodkowa

Obrót próbki z prędkością kątową ω w odległości r od osi poddaje ją przyspieszeniu odśrodkowemu, które konwencjonalnie określa się jako wielokrotność ziemskiego przyspieszenia – względną siłę odśrodkową, RCS (Relative Centrifugal Force), potocznie nazywaną '×g':

RCS = ω² . r / g ω = 2.π.N / 60 (N = prędkość obrotowa wirnika w rpm) przykład: N = 10 000 obr/min, r = 0,08 m -> ω ~ 1047 rad/s -> RCS ~ 9300 × g Ponieważ RCS zależy od kwadratu prędkości obrotowej wirnika, podwojenie rpm czterokrotnie zwiększa siłę – dlatego ustawianie prędkości w centryfugie ma duży wpływ na czas separacji i dlatego identyczny wirnik o prędkości 5000 obr/min i 15000 obr/min może sprawić różnicę między delikatną separacją plazmy a tak silną, że powoduje lizy komórek.

RCF = omega^2 . r / g          omega = 2.pi.N / 60   (N = rotor speed in rpm)

example: N = 10,000 rpm, r = 0.08 m  ->  omega ~ 1047 rad/s  ->  RCF ~ 9,300 x g

Prawo Stokesa: Jak szybko porusza się cząstka

Cząstka nie oddziela się natychmiast tylko dlatego, że działa na niej siła – porusza się z prędkością terminalną, którą ustala równowaga między tą siłą a lepkim oporem otaczającej cieczy. Dla małej kuli w przepływie laminarnym (niskim współczynniku Re) prawo Stokesa daje tę prędkość terminalnego osadzania, a wersja obrotowa prosto zastępuje przyspieszenie grawitacyjne ω²r:

v = d²/ (ρp - ρf) . omega^2 . r / (18 . eta) d = średnica cząstki ρp, ρf = gęstość cząstki, cieczy eta = lepkość cieczy Z tej równania wynikają dwie konsekwencje. Prędkość zależy od kwadratu średnicy, więc cząstka dwa razy większa osadza się cztery razy szybciej – dlatego też obroty różnicowe oddzielają próbki ze względu na rozmiar i gęstość etapami, krótko obracając przy niskiej prędkości, aby osadzić największe struktury, a następnie stopniowo zwiększając prędkość i czas trwania, aby wyodrębnić coraz mniejsze. Cząstka o gęstości dokładnie odpowiadającej otaczającej cieczy (ρp = ρf) ma zerową prędkość netto niezależnie od tego, jak mocno jest obracana – to podstawa separacji izopęcznościowej ('opartej na równowartości gęstości').

v = d^2 . (rho_p - rho_f) . omega^2 . r / (18 . eta)

d       = particle diameter
rho_p, rho_f = density of particle, of fluid
eta     = fluid viscosity

Rotacja różnicowa: oddzielanie krwi

Jedno próbki krwi obrócone w umiarkowanym tempie przez kilka minut klarownie dzieli się na trzy widoczne warstwy, wyłącznie ze względu na różnice gęstości. Erytrocyty, najgęstszy składnik, osadzają się na dnie. Powyżej znajduje się cienka, blada warstwa buforowa białych krwinek i płytek krwi, o pośredniej gęstości. Na wierzchu unosi się słomkowatożółte plasma, najmniej gęsta, zasadniczo woda z rozpuszczonymi białkami i czynnikami krzepnięcia. Ten sam etapowy proces – obrót, odprowadzenie nadwyżki płynnej fazy, ponowne rozpuszczenie osadu, kolejny obrót przy innej prędkości – jest standardowym przepływem pracy do izolowania wszystkiego od składników krwi po organelle podkomórkowe.

Centrifugacja gradientowa: sortowanie wyłącznie na podstawie gęstości

W celu uzyskania bardziej precyzyjnej separacji próbki są warstwowo nakładane na wstępnie utworzony gradient gęstości (zwykle sacharoza lub chlorek cesu, gęsty u dołu i rozcieńczony u góry) przed obrotem. Podczas centryfugacji rate-zonalnej cząsteczki oddziela się głównie ze względu na rozmiar i kształt, migrując z różnymi prędkościami przez gradient oraz proces jest zatrzymywany zanim wystąpi równowaga. W przypadku centryfugacji isocznej (w stanie równowagi) obrót trwa do momentu, w którym wszystkie cząsteczki przestają się poruszać – osadzają się w dokładnie tym punkcie gradientu, gdzie gęstość otaczającej cieczy odpowiada ich własnej gęstości. Dzięki temu oddzielenie odbywa się wyłącznie na podstawie gęstości, niezależnie od rozmiaru lub kształtu, co jest wystarczająco precyzyjne, aby rozdzielić DNA o lekko różniących się gęstościach, jak w klasycznym eksperymencie Meselsona-Stahla, który potwierdził semikonserwatywne replikację DNA.

Często zadawane pytania

Wypróbuj na żywo

Wszystko powyżej działa bezpośrednio w Twojej przeglądarce — otwórz Centrifuge i zmieniaj parametry podczas działania. Nic nie jest instalowane ani przesyłane na serwer, cały model działa w jednej karcie.