Функціональна генетика та генетичні скринінги

Вступ до Функціональної Генетики

Послідовне секвенування людського геному у 2001 році надав список деталей – приблизно 20 000 генів, що кодують білки, та мільйони регуляторних елементів. Однак знання послідовності не розкриває функцію генів. Функціональна генетика використовує підходи з високою пропускною здатністю для систематичного призначення біологічних функцій геномним елементам – через скринінги, що порушують гени (вимикаючи або змінюючи кожен ген окремо або одночасно), профілювання експресії генів (вимірювання реакцій на порушення), карти взаємодії білок-білок та інтегрований мультиомічний аналіз. Ці підходи трансформують біологію з описової в механістичну, ідентифікуючи цілі для лікарських препаратів, функції генів захворювань та генетичну архітектуру складних ознак на рівні геному.

Перехід від класичної генетики вперед (спочатку фенотип → картинг генів) до ретрогенетики (спочатку ген → фенотип) і тепер до масштабних геномних досліджень відображає фундаментальний зсув, який був дозволений за допомогою інструментів редагування геному CRISPR, технологій масового та пакетного скринінгу, а також одноклітинної секвенції. Скринінги втрати функцій на рівні геному CRISPR у людських клітинах тепер можуть одночасно перевіряти всі приблизно 20 000 основних генів щодо їх внеску в фенотип в одному експерименті – завдання, яке раніше вимагало 20 000 окремих експериментів за допомогою попередніх технологій. DepMap (Карта залежності від раку) профілював генетичні залежності (скринінги CRISPR) та чутливість до ліків у понад 1000 клітин ракових пухлин, створюючи публічний ресурс, який пов’язує геномні особливості з терапевтичною вразливістю.

Скринінги на основі CRISPR

Збірки скринінгів із втратою функції

Збірки скринінгів із використанням CRISPR забезпечують бібліотеку з десятків тисяч sgRNA (4-6 на ген) за допомогою латентної транскуляції при низькій мультиплікації (один sgRNA на клітину), відбирають фенотип протягом часу (життєздатність, стійкість до ліків, активація репортера), а потім кількісно визначають представництво sgRNA шляхом глибокого секвенування порівняння популяцій до та після відбору. Алгоритми MAGeCK, BAGEL і CRISPRscore статистично ідентифікують знесилені (важливі гени) або збагачені (гени стійкості) sgRNA на основі порівняння кількостей. Скринінги на основі геному в цілому виявили близько 2000 ключових важливих генів у ракових клітинах; контекстно-залежні залежності ідентифікують специфічні для пухлини вразливості (залежність від KRAS у пухлинах з мутацією KRAS, залежність від AR у раку простати, EZH2 у пухлинах з мутацією NSD1). Проєкт DepMap від Інституту Broad і проєкт Sanger Institute Project Score профілювали залежності в сотнях ліній ракових клітин із зіставленою генетичною інформацією — виявивши генетичні біомаркери конкретних залежностей.

CRISPRa та CRISPRi скринінги

CRISPRa (активація) використовує dCas9, поєднаний з транскрипційними активаторами (VP64, VPR, система SAM із MS2 RNA аптамерами для залучення додаткових активаторів), щоб підвищити експресію генів з ендогенних промоторів; CRISPRi (інтерференція) використовує dCas9, поєднаний з доменом KRAB реп’юсора, щоб припинити транскрипцію без розрізання ДНК. Скринінги CRISPRa на основі геному в цілому ідентифікують фактори пригнічення при набутті функції; CRISPRi забезпечує більш однорідне та зворотне пригнічення генів, ніж нікліазний вимикач, що дозволяє кількісно аналізувати фенотипи в діапазонах доз генів. Скринінги CRISPRa in vivo у мишей ідентифікували метаболічні регуляторні гени, які пригнічують неалкогольну жирову хворобу; скринінги CRISPRi в Т-клітинах ідентифікували механізми стійкості до контрольних точок. Скринінги на основі редагування базових параментів використовують редактори цитозину та аденіну для систематичного введення варіантів, пов’язаних із захворюванням, по всьому геному, створюючи карти сатурації мутацій, які допомагають інтерпретувати патогенність варіантів.

Perturb-seq та багатоможливі скринінги

Скринінг на основі окремих клітин CRISPR поєднує мутації CRISPR з транскриптомною трансляцією – вимірюючи відповідь геному окремо для кожної мутації у спільному форматі. Клітини отримують індивідуальні sgRNA через латекулярну доставку; ідентичність sgRNA читається з бібліотеки scRNA за допомогою баркодів sgRNA-захоплення, виражених у складі sgRNA конструкції. Це дозволяє: вимірювати фенотипову відповідь кожної мутації на рівні транскриптома; ідентифікувати зв'язки між генами та логіку мережі генів; класифікувати ефекти мутацій у шляхи за допомогою кластеризації шаблонів транскрипційної відповіді; призначати непересічні функції генам у шляху без введення плутання вторинними ефектами. Експерименти на основі масштабу генів з до 2 мільйонів клітин (Replogle et al. 2022) одночасно вимірювали транскрипційні відповіді всіх важливих генів.

Інтеграція багатьох омік

Жоден окремий омічний шар повністю не пояснює біологічної функції – інтегрування декількох типів даних (варіації геному → еQTL → протеоміка → метаболоміка → фенотип) забезпечує механістичні ланцюги від генетичного причини до фенотипового наслідку. DepMap інтегрує дані про залежність CRISPR з багатоомними профілями клітин ракових пущин (числові коливання, мутації, метилювання, експресія генів, протеоміка), щоб побудувати прогнозовані моделі терапевтичної вразливості. MoTrPAC (Консорціум молекулярних перетворювачів фізичної активності) інтегрував 25 молекулярних аналізів у 19 тканинах до та після тренувань на витривалість у щурів, з’єднуючи багатоомні вузли, чутливі до фізичних навантажень, з фенотиповими показниками здоров'я. Просторова транскриптомія (Visium, Slide-seq, MERFISH) додає просторову вимірність тканини до інтеграції багатьох омік – відображаючи експресію генів на архітектуру тканини для розуміння клітинної комунікації в її анатомічному контексті.

Приклади та застосування

Приклад 1: Скринінги синтетичної летальності”, «синтетична летальність» — це коли дві окремі мутації, кожна з яких індивідуально виживає, але смертельні в комбінації, надають специфічні терапевтичні вікна для раку. Інгібітори PARP використовують синтетичну летальність у пухлинах з мутаціями BRCA1/2: втрата BRCA1/2 порушує гомологічний рекомбінацію (ГР); інгібування PARP зупиняє вирій, який потребує ГР для розв’язання; клітини BRCA-недостатні не можуть розв’язати вирій та гинуть. Узгодження Olaparib, rucaparib, niraparib та talazoparib у пухлинах з мутаціями BRCA на грудях, яєчниках, простати та підшлункової залози представляють собою найуспішніше клінічне перетворення синтетичної летальності. Скринінги синтетичної летальності на широкій основі з CRISPR ідентифікують додаткові пари — залежність від гелікази WRN у пухлинах з нестабільністю мікросателітів, залежність POLRMT у пухлин з ампліфікацією MYC, MTHFD2 у багатьох генотипах раку, кожна з яких забезпечує нові лікарські засоби на основі синтетичної летальності для цільових уразливостей пухлини.

Приклад 2: GWAS виявлення функцій

Більшість асоціацій GWAS (>90%) знаходяться в не-кодуючих міжгенних або інтродюських областях — це складнощі з інтерпретацією функціонального механізму. Функціоногенетика встановлює зв’язки сигналів GWAS із причинними варіантами та генами: eQTL (поліморфізми експресії генів) — варіанти, що впливають на експресію сусідніх генів у певних тканинах з GTEx — ідентифікують ймовірний причинний ген, коли сигнали GWAS та eQTL збігаються (перевіряється статистичною збіжністю). Дані секвенування DNase-seq ENCODE та H3K27ac ChIP-seq визначають, чи потрапляють варіанти GWAS у активні інтервали або промотори в відповідних клітинних типах. Методи кроссінгування CRISPR насичують конкретні регіони GWAS варіантами, що ідентифікують функціональні нуклеотиди. Розгортання fine-mapping (SuSiE, FINEMAP) звужує надійні набори з сотень кандидатів до кількох варіантів. Робочі процеси інтеграції GWAS, QTL та функціонального аннотування ідентифікують лікарські цілі з досліджень асоціацій між захворюваннями та генетикою.

Приклад 3: Скринінги за допомогою інтерференції РНК

Скринінги за допомогою інтерференції РНК (RNAi) з бібліотеками siRNA, що націлені на кожен людський ген, були першими масштабними втратами функції в людських клітинах (до CRISPR). Скринінги на широкій основі з siRNA ідентифікували необхідні гени для вірусного реплікації (фактори залежності від HIV: TSG101, гени транспорту ядра, NPC1 для потрапляння ебола), необхідні гени ракових клітин та цілі для лікарських засобів. Скринінги з використанням RNAi мають значні побічні ефекти (перехресна реактивність послідовностей seed), що ускладнює інтерпретацію; CRISPR KO та CRISPRi забезпечують чистіше порушення та, в основному, замінили siRNA для об’єднаних скринінгів. Налаштовані бібліотеки siRNA/ASO залишаються цінними для конкретних застосувань (макроскопічні екрани для морфологічних фенотипів; скринінги в первинних клітинах, де інфекція з використанням латевірусного MOI занадто чутлива). Бібліотеки shRNA (VIPER, Sigma MISSION) забезпечують стабільне довготривале придушення для скринінгів in vivo, які неможливо здійснити з тимчасовим трансфектом siRNA.

Приклад 4: Скринінги за допомогою макроскопічної імітації

Скринінги за допомогою макроскопічної імітації (HCI) поєднують автоматизовану конфокальну мікроскопію з аналізом зображень на основі машинного навчання для вимірювання складних морфологічних фенотипів у скринінгах широкого спектру порушень. Cell Painting — це протокол фарбування 6-флуорофорами, що одночасно позначає ядро, цитоплазму, мітохондрії, ЕР, нуклеолі та F-актин, який генерує приблизно 1500 морфологічних ознак на клітину для фенотипового відбитку. Морфологічні профілі, отримані з CRISPR-мутацій або лікування препаратами, кластеризуються за спільними біологічними процесами — гени в одному шляху мають подібні морфологічні профілі, що дозволяє відкривати шляхи. Rxrx (Recursion Pharmaceuticals) Cell Painting скринінги мільйонів комбінацій препарат-клітин створили найбілький морфологічний набір зображень у сфері розробки ліків. Проект Human Cell Map систематично профілює просторове розташування людського протеома за допомогою фарбування флуоресцентними барвниками HCI — створюючи зображену карту локалізації білків, порівнянну з Human Protein Atlas.

Приклад 5: CRISPR Knockin для насиченого редагування геному

Насичене редагування геному (SGE) вводить кожен можливий однонуклеотидний варіант (SNV) у цільовій області — зазвичай охоплюючи клінічно важливий ген або локус інтересу, і вимірює вплив кожного варіанту на життєздатність клітин або конкретний показник. Findlay et al. (2019) SGE BRCA1 екзонів протестував 3893 однонуклеотидних варіантів одночасно, функціонально класифікував кожен як функціональний, проміжний або нефункціональний — створюючи клінічну інтерпретацію справдності для понад 95% екзомних варіантів BRCA місяць до того, як вони були коли-небудь зустрічені клінічно. SGE дозволяє попереднє функціональне класифікування клінічних варіантів у масштабі замість очікування невизначених варіантів, які зустрічаються в пацієнтах. Аналогічні підходи застосовуються до TP53, PTEN, MSH2, LDLR та інших клінічно важливих генів — генерують емпіричну функціональну класифікацію для всіх можливих варіантів як клінічний генетичний ресурс.

Приклад 6: Скринінги відповіді на пошкодження ДНК

Скринінги за допомогою іонізуючого випромінювання та скринінги з хіміотерапією визначають гени, втрата яких збільшує чутливість або надає стійкість до агенцій, що викликають пошкодження ДНК, формуючи раціональні комбінації терапії та предикторні біомаркери. Скринінги на широкій основі з CRISPR у ракових клітинах, оброблених PARP-іншібіторами, цисплатином або олапарібом, ідентифікували гени, включаючи PARG (полі-АДРГ-гідролазу — її пригнічення збільшує чутливість до PARP-іншібіторів), RNF8/168 (убіквітинні лігази в ШР шляху) та комплекс 53BP1/SHIELDIN (який протидіє ШР — його втрата відновлює ШР у клітинах BRCA1/2-недостатніх, надаючи PARP-іншібітор стійкість, але покращуючи AUC олапарібу після хіміотерапії), CTC1-STN1-TEN1 комплекс втрати забезпечує чутливість до ATR-іншібіторів, пояснюючи синтетичну летальність ATR-іншібіторів у клітинах з експресією CDC25A. Ці механістичні інсайти з масштабних скринінгів безпосередньо формують дизайн клінічних випробувань для комбінованих терапій та стратифікацію пацієнтів.

Приклад 7: In vivo CRISPR скринінги

Скринінги з використанням CRISPR in vivo ідентифікують гени, які працюють у фізіологічних контекстах, недоступних для культивування клітин. In vivo CRISPR скринінги в мишах моделей пухлини ідентифікують гени-супресори та промоутери метастазування шляхом порівняння кількості sgRNA в первинних пухлинах з метастазами — ідентифікуються ETV6, втрата PARD3 сприяє метастазуванню раку грудей у печінку. In vivo скринінги в CAR-T клітинах виявили REGNASE-1 як негативний регулятор — його видалення покращує антипухлинну функцію CAR-T в пухлинах на твердих тілах. Скринінги з використанням AAV-CRISPR для проведення локалізованих скринінгів in vivo на печінку, легензі та ЦНС у мишах на високожирній дієті ідентифікували NSD3 та раніше невідомі метаболічні регулятори. Збіркова доставка AAV забезпечує in vivo скринінги на печінці, легензі та ЦНС у мишей; майбутні in vivo скринінги в нелюдних приматах або пацієнтах з трансплантацією пухлинних клітин ще більше зблизять передову та клінічну діяльність.

Приклад 8: Базове редагування скринінгів для клінічних варіантів

Базові редагування (ABE) — це систематичне введення точкових мутацій у відповідних за спадковістю ділянках, а також вимірювання функціональних наслідків у популяції. Масштабне редагування за допомогою аденоїнового базового редагування (ABE) скринінги в клітинах CML, що наповнюють домен кінази BCR-ABL, вводили тисячі однонуклеотидних варіантів, вимірюючи опір іматинібу, дасатинабу та ацецимінібу — генерували карти резистентності мутацій, які прогнозують, які з них ще не зустрічалися клінічно, місяць до того, як вони були коли-небудь зустрічені клінічно. SGE дозволяє попереднє функціональне класифікування клінічних варіантів у масштабі замість очікування невизначених варіантів, які зустрічаються в пацієнтах. Аналогічні підходи застосовуються до TP53, PTEN, MSH2, LDLR та інших клінічно важливих генів — генерують емпіричну функціональну класифікацію для всіх можливих варіантів як клінічний генетичний ресурс.

Спробуйте онлайн

Все вище працює у вашому браузері – відкрийте симулятор CRISPR Genetic Screen Simulator та змінюйте параметри під час його роботи. Не встановлюється нічого, не завантажуються дані, весь модель живе в одному вікні.

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте CRISPR Genetic Screen Simulator і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.