Регенеративна біологія та репарація тканин

Вступ до регенеративної біології

Регенерація – здатність відновлювати, замінювати або регенерувати втрачені чи пошкоджені тканини та органи – значно варіюється в межах дерева життя. Планарії (плоскі черви) можуть повністю регенерувати організм із невеликого фрагменту; саламандри-ахолікти регенерують цілі кінцівки, частини серця та частини мозку; коротке риби регенерують серцеве м'язове волокно, плавники та спинний мозок; у дорослих ссавних відновлювальна здатність обмежена – загоєння шкірних ран шляхом утворення рубців замість ідеальної регенерації, а також регенерація лише певних тканин (печінка, кишечник, кістковий мозок). Розуміння того, чому ссавці погано регенерують порівняно з амфібіями та молекулярних механізмів, які забезпечують кращу регенерацію у модельних організмах, допомагає розробляти стратегії регенеративної медицини для підвищення здатності до відновлення у людини.

Регенеративна медицина має на меті замінювати, відновлювати або регенерувати людські клітини, тканини чи органи для відновлення нормальної функції – шляхом клітинних терапій (трансплантації стовбурових або диференційованих клітин), тканинної інженерії (об'єднання клітин із каркасами для створення замісних тканин *ex vivo*), генної терапії, яка відновлює втрачену функцію, та стратегій стимулювання ендогенного відновлення шляхом активації неактивних регенеративних програм у тканинах дорослих пацієнтів. Прогрес у технологіях iPSC, культивування органоїдів, методи децелюляризації та біоматеріальних каркасів робить регенеративні терапії все більш практичними для захворювань, які вражають тканини з мінімальною природною регенерацією – серце, спинний мозок, сітківка та бета-клітини підшлункової залози.

Організми-моделі для регенерації

Лімб Регенерації Хвоста у Жаберногих Крокодилів (Axolotl)

Лімб регенерації хвоста у жаберних крокодилів (Ambystoma mexicanum) проходить через три основні етапи: загоєння рани (міграція шкіри покриває рану протягом кількох годин); формування бластемы (дедиференціація м’язових, хрящових та шкірних фібробластів біля площини ампутації, утворюючи проліферативну масу багатопотенційних периферійних клітин – бластема); та регенеративний ріст і формування шаблону (клітини бластеми передиференціюються та специфічно формують всю структуру кінцівки). Лінійне відстеження з використанням флуоресцентних біопсинів демонструє, що дедиференційовані м’язові клітини реформуються в м’язи, а фібробласти реформуються як сполучна тканина – що свідчить про обмежене транздиференціювання, але значний повторний вхід в клітинний цикл диференційованих клітин. Положення інформація, яка дозволяє правильно формувати цифри та структури регенерату, включає сигналізацію Wnt, BMP і FGF, які перерозподіляють програми розвитку, унікальні для базованих тетраподів, які не припинені в ссавцях. Пам’ять про положення сполучної тканини фібробластів (кодова HOX) дозволяє регенерувати правильну скелетну структуру на кожному рівні кінцівки.

Регенерація Серця Риби-Немо Manžel

Риба-немо відновлює 20% серцевого м’язу, видаленого резекцією протягом 30 днів, шляхом дедиференціації кардіоміоцитів, проліферації та редиференціації – не через пул кардіопрогенних клітин. Транзиторна здатність до регенерації у новонароджених мишей зберігається протягом перших 7 днів життя (модель пошкодження резекцією), а потім втрачається, замінена фіброзним ремоделюванням. Шляха сигналізації Hippo/YAP – який сприяє проліферації кардіоміоцитів при активації у рибі-немо – вимикається в дорослих ссавців, коли кардіоміоцити завершують цикл клітинного поділу. Перевираження YAP1 у кардіоміоцитах мишей частково відновлює потенціал до проліферації після інфаркту міокарда. Фармакологічна інактивація сигналів EGFR та NRG1/ErbB2, поєднана з пригніченням інгібуючих шляхів (Hippo, p38 MAPK), частково відновлює кардіальний регенеративний потенціал у серцях дорослих тварин у попередніх моделях.

Шищення у тварин

Фази процесу загоєння ран

Шищення у тварин відбувається через чотири перекрилювані фази: гемостаз (агрегація тромбоцитів, утворення згортального клубка протягом декількох хвилин – запечатування рани та забезпечення тимчасової матриці внематочкового матрикса); запалення (рекрутинг нейтрофілів і макрофагів протягом годин – видалення бактерій і сміття, вивільнення цитокінів [TNF, IL-6], які активують подальші реакції регенерації); проліферація (міграція фібробластів та відкладення колагену, ре-епітелізація кератиноцитів, ангіогенез – пік досягається на 3-14 днях); і ремоделювання (тип III колаген замінюється типом I колагену, поступове скорочення рани міофібробластами, зрілість рубця – місяці до років). Шкідливе шищення проявляється у хронічних незгоєних ранах (діабетичні гальні – порушення поляризації макрофагів та ангіогенезу) або гіпертрофних рубцях/келоїдах (надмірна активація фібробластів та відкладення колагену).

Ролі макрофагів у регенерації

Мешкаючі в тканині та рекрутовані макрофаги є важливими координаторами процесу загоєння ран – придушення меригелоцитарних клітин призводить до порушення загоєння ран. Ранні макрофаги рани (M1-подібні) виробляють TNF, IL-1β та ROS для видалення бактерій і сміття; пізні макрофаги рани (M2-подібні) виробляють TGF-β, IL-10, VEGF та FGF – сприяючи відкладенню матриці, ангіогенезу та розв’язанню запалення. Діабетичні рани характеризуються постійним 'застряглим' M1 фенотипом макрофагів, який не переходить у про-регенераційний стан M2 – кілька кандидатів на змушення переходу M2 (локальна доставка IL-4, IL-10, інабiндування miR-155) перебувають на стадії розробки. Інженерні біоактивні пов’язки, що доставляють цитокіни, міРН або сигнали приваблювання макрофагів у ранову тканину, представляють клінічно реалізований підхід до відновлення порушеного загоєння, що опосередковується макрофагами, у діабетичних та венозних уражень стоп.

Фіброз проти регенерації

Загальний відповідь тварин на серйозне пошкодження тканин – це фіброз – заміна нормальних клітин паренхіми колагеновим рубцем, синтезованим активними міофібробластами (від портальних фібробластів, гепатоцитів, легеневих фібробластів, кардіальних фібробластів). TGF-β1 є головним проліферативним цитокіном – сигналізує через SMAD2/3, щоб стимулювати перехід клітин фібробласта в міофібробласт (вираження альфа-SMA, віментину, FAP), надмірний секрет колагену I та фібronectin, а також стійкість до апоптозу. Фіброз призводить до прогресивного порушення функції органів у печінці (цироз), легенях (IPF), нирках, серці та шкірі (склеродермія). Розуміння того, чому деякі види уникають фіброзу (MRL/lpr супер-регенератори мишей, спинорогі миші Acomys з регенеруванням шкіри без рубців) допомагає ідентифікувати антифібротичні цілі. Перемикання фенотипу макрофагів, модуляція шляху YAP та сеноліз CAF є антифібротичними стратегіями, що випливають із порівняльної регенераторної біології.

Приклади та застосування

Приклад 1: Регенерація кишечника

Кишечник відновлюється повністю кожні 3-5 днів – одне з найшвидших регенеруючих тканин у ссавців – завдяки Lgr5+ столовим колоніальним (CBC) стовпчастим клітинам, які безперервно виробляють дочірні клітини, що диференціюються, коли вони мігрують вздовж осі крипто-вилики. Після травми кишечника (радіація, інфекція, запалення) резервні +4 позиції неактивних стовбурових клітин (Bmi1+, Hopx+, Lrig1+) які вижили під час травми можуть заселити пул Lgr5+ CBC стовбурових клітин і відновити повні крипти. Крім того, секреторні прогенітори (зазвичай залучені до диференціації) можуть редиференціюватися назад у стовбурові клітини при сильних травмах, демонструючи вражаючу клітинну пластичність при відновленні кишечника. Ці висновки допомагають керувати радіаційним ентеритом, ІБС та гастритом, спричиненим хіміотерапією, і направляють терапевтичні методи на основі органоїдів, використовуючи пересаджені фрагменти органів, що містять нові стовбурові клітини для відновлення ураженого слизового шару.

Приклад 2: Відновлення периферичної нервової системи за допомогою Schwann-клітин

Периферичні нерви у ссавців успішно регенеруються після травми через дегенерацію Валлеріана (видалення віддалевого аксону та мієліну Schwann-клітинами, які набувають репаративного фенотипу) за цим супроводжується ростом аксонів, керованим смугами Buchner tubes, утвореними Schwann-клітинами – спеціалізованою клітинною scaffold. Репаративні Schwann-клетки дедиференціюються від мієлінзаготівельної ідентичності та перепрограмовуються для експресії c-Jun, Shh, GDNF, BDNF, та NCAM, що сприяє росту аксонів – вражаючий приклад регенеративної здатності нервової системи ссавців. Швидкість регенерації периферичного нерва становить приблизно 1 мм/день; успішне відновлення вимагає точного збігу аксона та цілі. На відміну від цього, центральна нервова система (ЦНС) не регенерується після травми – оскільки мієлінові білки ЦНС (MAG, Nogo-A, OMgp) активують сигналу RhoA, що пригнічує ріст аксонів, а олігодендроцити ЦНС не мають репаративного фенотипу Schwann-клітин. Визначення молекулярних відмінностей та відтворення репаративних функцій Schwann-клітин у ЦНС (антитела до рецепторів Nogo, інгібітори RhoA) є терапевтичним підходом для лікування травм спинного мозку.

Приклад 3: Регенерація та необласти у плоских черв’яків Planaria

Плоскі черви Planaria можуть регенерувати повну організм з кількох сотень клітин завдяки необластам – єдиним мітотично активним клітинам дорослих в дорослих – які є плюрапотентними довшими стовбуровими клітинами, що складають приблизно 25% клітин Planaria. Після ампутації необласти поблизу рани проліферують і утворюють бластму; позиційні необласти, які експресують ГЕНІ Х, відновлюють правильну анатомію. Молекулярне розрізнення регенерації Planaria (за лабораторіями Пітера Реддена, Алехандро Санчеса-Альварадо) за допомогою RNAi виявило сотні регуляторів, включаючи PIWI-гомеологов (необхідні для підтримки необластів), факторів плюрапотентності стовбурових клітин (nanos, гомеологи Sox2), та молекул патернізації АПІ (система Wnt перевернута від хребетних – Wnt визначає хвіст, а не голову). Системи Planaria надають уявлення про досягнення цілотілесної регенерації з дорослих стовбурових клітин із потенційними наслідками для розширення регенеративних можливостей ссавців.

Приклад 4: Регенерація та загоєння перелому кісток

Регенерація кістки після перелому передбачає простірні та ендостеальні стовбурові клітини (які експресують маркери Prx1, Sox9, Osterix) утворюють вивих при переломі. Безпосередня оссифікація з прогеніторів відбувається в перистеомі; енхондральна оссифікація формує хрящову матрицю, яка пізніше замінюється кісткою – обидва шляхи сприяють загоєнню перелому. BMP-2 та BMP-7 рекомбінантні білки прискорюють утворення вивиху (затверджені FDA для лікування діафрагмальних переломів та сполучної гілок), критичні дефекти кістки, що перевищують здатність до самовідновлення, вирішуються за допомогою інженерії кісткової тканини: декамедульовані кісткові матриці, що заселені MSCs, 3D-друк гідроксиапатитні матриці та генна терапія для доставки BMP-2 за допомогою аденовірусів або ліпідних наночастинок. Трансплантація перистеому, яка відновлює стовбурову клітинну нішу, забезпечує загоєння критичних дефектів у деяких моделях – перистеум як мінімально порушена трансплантована регенеративна тканина.

Приклад 5: Регенерація без рубців у миші Acomys (Spiny Mouse)

Acomys cahirinus (миша з шипами) регенерує повну товщину шкіри без утворення рубців – замінюючи всі шкірні придатки, включаючи волосяні фолікули, залози та дерму. На відміну від звичайних мишей, які утворюють рубці, рани Acomys швидше регенеруються, менше залучаються фібробласти, нижчий рівень сигналу TGF-β, макрофаги швидко поляризуються в протизапальний фенотип і відбувається розширення екстрацелюлярної матриці з контрольованим відкладенням колагену. Рани на вухах Acomys (діаметр 6 мм) повністю закриваються протягом 30 днів із відновленням кровоносних судин, волосяних фолікулів і хряща. Порівняння транскриптомів Acomys проти Mus (мишей, що утворюють рубці) виявило знижений рівень експресії цитокінів фібробластів та унікальний профіль активності матриксних металопротеїназ як ключові відмінності – потенційні терапевтичні цілі, які можна перенести для зменшення утворення рубців і лікування келоїдів.

Приклад 6: Лікарства на основі iPSC

Лікарські клітини, отримані з індукованих плюрапотентних стовбурових клітин (iPSC), забезпечують відновлюване джерело для терапевтичних клітин-трансплантатів: ретинална пігментна епітеліальна клітина від iPSC в клінічних випробуваннях для сухого ВМД відновлює підтримку фоторецепторів; дофамінові прогенітори від iPSC для хвороби Паркінсона показують ранші клінічні обіцянки (випробування Blouet/Schüle); бета-клітини підшлункової залози від iPSC (Vertex Pharmaceuticals клінічна програма, яка демонструє незалежність інсуліну при діабеті 1 типу); кардіоміоцити iPSC для відновлення міокарда після інфаркту. Ключові виклики: імунна відмова після всіхгенної трансплантації (iPSC з HLA-відповідністю; гіпоімунні iPSC з B2M/HLA knockouts та CD47/PD-L1 knock-ins); генетична нестабільність під час репрограмування та тривала культура; ризик пучини від неповністю диференційованих плюрапотентних клітин, що трансплантуються разом із цільовими клітинами; і забезпечення довготривалої імплантації та функції цільових клітин на місці пошкодження.

Приклад 7: Регенерація рогівки

Рогівковий епітелій підтримується Lgr5-негативними, ABCG2-позитивними лімбальними стовбуровими клітинами (LSC) в лімбальному нірі на кордоні рогівки та скроневої кістки – що мігрують центрично для заміни відірваних клітин рогового епітелію. Термічні опіки, синдром Стівена-Джонсона або хімічні пошкодження пошкоджують лімбальний нір, спричиняючи дефіцит лімбальних стовбурових клітин (LSCD), що призводить до сліпоти. Автологічна трансплантація LSC: невеликий біопсія з нездійсненого ока забезпечує LSC, розмножені на фібрині в культурі, потім трансплантовані на уражену рогівку – відновлює зір при LSCD. Holoclar (Chiesi Farmaceutici) став першою клітинною терапією, схваленою в Європі (2015) для лімбальної стовбурової клітини дефіциту. Генетично модифіковані LSC для ювенільного амбліопії (мутація LAMB3 виправляється за допомогою ретровірусного транскрипційного введення) послідовно зворотньо змінила хворобу у пацієнта, у якого тіло було в основному покрите трансплантованою шкірою.

Приклад 8: Трансплантація органоїдів

Органоїди, отримані з клітин пацієнтів, трансплантуються в пошкоджені органи і можуть імплантуватись, розмножуватись та відновлювати функцію. Органоїди кишечника, трансплантовані в хімічно уражений кишечник, імплантуються в слизову оболонку, диференціюються та регенерують велику поверхню епітелію – з повністю задокументованим функціональним відновленням слизової оболонки ендоскопічним методом. Лінійні органоїди людини трансплантуються в пошкоджені органи після колостомії або операції IPAA, що тестується клінічно. Органоїди печінки, згенеровані з iPSC, успішно відновили гіпотиреоз у мишах після трансплантації, відновлюючи циркулюючі гормони щитової залози. Органоїди щитовидної залози, згенеровані з iPSC, успішно відновили гіпотиреоз у мишах після трансплантації, відновлюючи циркулюючі гормони щитової залози. Збіг технологій органоїдів, точної хірургічної доставки та генної корекції для створення пацієнт-відповідних виправлених органоїдів для трансплантації представляє собою значний прогрес у регенеративній медицині, що наближається до клінічного застосування.

Спробуйте онлайн

Все вище працює у вашому браузері – відкрийте симулятор «Регенеративна біологія та репарація тканин» і змінюйте параметри під час його роботи. Не встановлюється нічого, не завантажуються дані, весь модель живе в одному вікні.

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Regenerative Biology & Tissue Repair Simulator і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.