🔬 Séquençage de l’ADN

Smith-Waterman est un algorithme de programmation dynamique pour l’alignement local de séquences, introduit par Temple Smith et Michael Waterman en 1981. Il remplit une matrice de scores où chaque cellule score(i,j) = max(score(i-1,j-1) + substitution(i,j), score(i-1,j) - pénalité_gap, score(i,j-1) - pénalité_gap, 0). Le plancher zéro est la différence clé par rapport à l’alignement global : il permet à un alignement de commencer n’importe où et de se terminer à n’importe quelle cellule à score élevé, ce qui le rend idéal pour faire correspondre des lectures courtes à une référence plus longue même lorsque la lecture est bruitée ou seulement partiellement chevauchante.

Un SNP est une position dans le génome où une seule base diffère entre individus ou entre un échantillon séquencé et une référence. Dans les données de séquençage, un SNP apparaît comme un désaccord constant sur de nombreuses lectures indépendantes à la même position. Les appelants de variants distinguent les vrais SNP des erreurs de séquençage en exigeant que la base alternative apparaisse dans une fraction minimale de lectures (typiquement 20–30 %) et à une couverture suffisante (souvent au moins 8x). Les erreurs aléatoires sont dispersées à travers les lectures et les positions, tandis qu’un vrai SNP réapparaît au même site dans chaque lecture qui le couvre.

N50 est la longueur du plus court contig dans l’ensemble des plus longs contigs qui couvrent ensemble au moins 50 % de la longueur totale de l’assemblage. C’est une médiane pondérée par la longueur plutôt qu’une simple moyenne : une poignée de longs contigs peut faire monter le N50 même s’il existe de nombreux contigs courts. Dans cette simulation, une couverture plus élevée et des taux d’erreur plus faibles produisent moins de contigs, plus longs, et donc un N50 plus élevé. Cette métrique est la référence standard pour comparer la contiguïté des assemblages de génomes ; un assemblage de génome humain avec un N50 supérieur à 10 Mb est considéré à l’échelle chromosomique.

Frederick Sanger et Walter Gilbert ont développé indépendamment les premières méthodes de séquençage pratiques en 1977, partageant le prix Nobel de chimie en 1980. La méthode de terminaison de chaîne de Sanger est devenue le cheval de bataille du Projet du Génome Humain, achevé en 2003 pour un coût d’environ trois milliards de dollars. Le lancement des plateformes de lecture courte d’Illumina au milieu des années 2000 a réduit le coût par génome à moins de mille dollars d’ici 2014. Oxford Nanopore et Pacific Biosciences ont ensuite introduit le séquençage de lecture longue, permettant un assemblage quasi complet de génomes complexes, y compris la première séquence de référence humaine sans lacune publiée en 2022.

La génomique clinique utilise le séquençage pour diagnostiquer des troubles génétiques rares, guider le traitement du cancer par le profilage des mutations tumorales, et dépister les nouveau-nés pour des centaines de maladies héréditaires. La génomique des maladies infectieuses a permis le suivi rapide des variants du SARS-CoV-2 pendant la pandémie de COVID-19. L’agriculture applique le séquençage pour sélectionner des variétés de cultures résistantes aux maladies et à haut rendement. La science médico-légale utilise le profilage par répétitions courtes en tandem (STR) pour l’identification, et le séquençage de l’ADN environnemental (ADNe) permet aux écologistes de recenser la biodiversité à partir d’échantillons d’eau ou de sol sans capturer d’organismes.

Pas nécessairement. La couverture suit une loi de rendement décroissant : passer de 5x à 30x améliore considérablement la complétude de l’assemblage et la précision des SNP, mais passer de 100x à 500x ajoute peu pour un génome diploïde standard. Une couverture extrêmement élevée peut même introduire du bruit car des artefacts de séquençage — tels que des duplicats optiques sur les plateformes Illumina — s’accumulent et doivent être supprimés. Pour la plupart des études de variants germinaux, 30x est standard ; pour la détection de mutations somatiques dans le cancer, où seule une fraction des cellules porte la mutation, une couverture ciblée de 100–1000x peut être requise.

L’alignement cartographie les lectures sur une séquence de référence existante ; l’assemblage reconstruit une séquence à partir de zéro sans référence en utilisant uniquement les chevauchements entre lectures. L’approche overlap-layout-consensus (OLC) utilisée dans cette simulation trouve des paires de lectures qui partagent un chevauchement suffixe-préfixe, construit un graphe de chevauchement, trouve un chemin à travers celui-ci (layout), et dérive une base consensus à chaque position. L’assemblage par graphe de De Bruijn, utilisé par des outils tels que SPAdes et Velvet, est une alternative qui découpe les lectures en courts k-mers et convient mieux aux lectures courtes Illumina. Les assembleurs de lectures longues tels que Flye et Hifiasm peuvent produire des chromosomes quasi complets en une seule exécution.

Les régions hautement répétitives — centromères, télomères et duplications segmentaires — restent difficiles à assembler car les lectures plus courtes que l’unité répétée ne peuvent pas les couvrir sans ambiguïté ; seules les lectures ultra-longues (100 kb et plus) d’Oxford Nanopore les résolvent. Le phasage des haplotypes, qui détermine quels variants se produisent sur la même copie de chromosome, reste encore exigeant en calcul pour les génomes diploïdes ou polyploïdes hétérozygotes. Le séquençage épigénomique qui lit simultanément la séquence de bases et la méthylation de l’ADN à partir de la même molécule est une capacité émergente. La transcriptomique spatiale, qui cartographie l’expression des gènes à des emplacements physiques au sein de coupes de tissus, et le séquençage unicellulaire qui séquence des cellules individuelles plutôt que des populations en vrac, élargissent rapidement la portée de ce que le séquençage peut révéler.