Мас-спектрометрія: Вимірювання маси молекул за часом польоту

Що насправді вимірює мас-спектрометр

Незважаючи на назву, мас-спектрометр ніколи не вимірює масу безпосередньо. Що він вимірює – це відношення маси до заряду, записане як m/z, де m є масою іона, а z – кількість елементарних зарядів, які він несе. Причина цього вкрай практична: будь-який метод, який використовується для маніпулювання та виявлення молекули всередині приладу – чи то прискорення її в електричному полі, чи викривлення її шляху в магнітному полі – реагує на силу, що діє на заряд, і ця сила залежить як від маси, так і від заряду разом, а не лише від маси. Молекула, яка втратила два електрони, поводиться дуже інакше, ніж ідентична молекула, яка втратила лише один електрон, хоча їхні маси майже однакові, оскільки подвоєний заряд відчуває вдвічі більшу прискорення. Саме тому кожен пік у мас-спектрі відображається значенням m/z замість значення маси, і хімікам необхідно знати або вивести стан заряду z перед тим, як перетворити виміряне m/z на фактичну молекулярну масу. Для більшості невеликих органічних молекул, які іонізуються з одним зарядом, z дорівнює 1, а m/z числово дуже близьке до молекулярної маси в атомних одиницях маси, але для великих біомолекул, таких як білки, які можуть одночасно притягувати багато зарядів, це розрізнення стає вирішальним для правильної інтерпретації даних.

Перетворення нейтральної молекули на заряджений промінь

Перш ніж будь-що можна прискорювати або вимірювати час польоту, зразок необхідно перетворити на газофазні іони, оскільки електричні поля не мають впливу на нейтральну молекулу. Двоє методів іонізації домінують у сучасному мас-спектрометрії: електроспрейна (ESI) штовхає рідкий зразок через тонлу гостру голівку, заряджену електрично, утворюючи туман мікроскопічних заряджених крапель; коли розчинник випаровується, заряд концентрується доки краплі не тріскаються та знову тріскаються, зрештою залишаючи за собою голі молекулярні іони, часто з кількома зарядами для великих молекул. Матрицево-підтримувана лазерна десорбція/іонізація (MALDI) замість цього змішує зразок із світлопоглинальною матричною сполукою, кристалізує її на металевій пластині та обстрілює коротким лазерним імпульсом; матриця поглинає енергію лазера, вибухово випаровується і переносить молекули зразка в газову фазу вже заряджені, зазвичай із одним зарядом. Обидва методи цінуються як м’які методи іонізації, оскільки вони додають або видаляють заряд без руйнування крихкої молекули, що надзвичайно важливо для ідентифікації великих, делікатних біомолекул, таких як незруйновані протеїни, які розпадалися б під впливом більш жорстких методів іонізації.”]}**”**

Від напруги та відстані до часу вимірювання

Після іонування молекула потрапляє в серце часівки (TOF) – зону прискорення, за якою слідує довгий трубка польоту під вакуумом, де утримується відсутність електричного поля. Іон з зарядом q прискорюється через фіксовану напругу V, і вся енергія, що витрачається на нього, qV, перетворюється в кінетичну енергію, тобто qV = (1/2) * m * v^2, де m – маса, а v – швидкість. Розв’язуючи рівняння для швидкості, отримуємо v = √(2qV / m). Таким чином, кожен іон, прискорений через одну й ту ж напругу V, виходить із зони прискорення з такою швидкістю, яка залежить лише від співвідношення m/q: легші іони та іони з більш високим зарядом вилітають швидше, а важчі або менш заряджені іони – повільніше. Іон потім котиться з цією постійною швидкістю по трубці польоту фіксованої довжини L, де на нього не діє жодна сила, тому час, необхідний йому для досягнення детектора, просто дорівнює t = L / v. Підставляючи вираз для v, отримуємо центральне рівняння часу польоту: t = √(L / (2qV)). Підносячи обидві частини рівняння до квадрату та переупорядковуючи їх, ми бачимо, що m/q пропорційне t^2, а саме m/q = (2V / L^2) * t^2, що означає, що інструмент може безпосередньо перетворити одне точно виміряне час прибуття на співвідношення маси до заряду, використовуючи лише відому напругу V і відому довжину трубки L. Оскільки важкі іони з однаковим зарядом витрачають помітно більше часу на перетин трубки, сортування за часом прибуття еквівалентне сортуванню молекул за масою.

Інтерпретація мас-спектру: Маса та структура разом

Детектор на кінці трубки польоту записує кількість іонів, що потрапляють на нього в певний час прибуття, а програмне забезпечення інструменту перетворює це у мас-спектр – графік, який показує відносну кількість іонів вздовж вертикальної осі та значення m/z (маса до заряду) вздовж горизонтальної осі. Найпростіші мас-спектри демонструють один домінуючий пік, що відповідає нерозсіяному молекулярному йону, а знаючи заряд йону, значення m/z дає масу молекули безпосередньо, часто досить точно, щоб розрізняти кандидатів у молекулярні формули, які відрізняються лише на одиницю атомної маси. Однак, молекули часто розпадаються під час або після іонізації, особливо коли до них додається додаткова енергія в техніці тандемного мас-спектрометрії, і цей «спрід» менших фрагментних іонів створює власний пік з відповідним значенням m/z. Оскільки молекула зазвичай розпадається у найслабшій хімічній зв’язці, схема значень маси фрагментів діє як набір пазлів: різниця між значеннями m/z сусідніх піків розкриває, які елементи, такі як певна амінокислотна група або метильна група, були зв’язані в оригінальній структурі. Тому інтерпретація мас-спектру – це двоступеневий процес: спочатку визначається загальна молекулярна маса з піку нерозсіяного йону, а потім реконструюється структурне з’єднання на основі сходинки фрагментних піків під ним.

Від лабораторного столу до реального світу

Мас-спектрометрія, а також мас-спектрометрія загалом, стала незамінною в науці завдяки тому, що вона ідентифікує молекули з надзвичайно малих зразків із високою точністю. У протеоміці дослідники розщеплюють білки на короткі пептиди, вимірюють їхню масу та фрагментаційні закономірності та співвідносять результати з базами даних, отриманих з геному, щоб визначити, які білки були присутніми в клітинному чи тканини зразку, часто тисячі одночасно. У допінгових тестах у спорті мас-спектрометрія виявляє сліди заборонених речовин або їх метаболічні продукти в сечі та крові спортсменів на концентраціях, значно нижчих за те, що інші методи можуть надійно розрізняти від шуму. У криміналістиці вона ідентифікує невідомі порошки, залишки та наркотики, вилучені з місць злочинів, порівнюючи їхні відбитки фрагментації з посиланнями на бібліотеки, що надає докази, які можуть стояти на захисті в суді. І в аналізі ізотопних співвідношень високоточні мас-спектрометри розділяють атоми, що відрізняються лише на один або два нейтрони, такі як вуглець-12 проти вуглецю-13, щоб датувати археологічні зразки, відстежувати географічне походження продуктів харчування та вина або відновлювати давні кліматичні записи, зафіксовані в крижах льоду та шарах осадових порід.

Часті запитання

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Mass Spectrometry: Weighing Molecules by Their Flight Time і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.