Резонанс поверхневих плазм: спостереження за зв’язуванням молекул у реальному часі

Фізика поверхневих плазмонів

Поверхневий плазмон – це квант колективної коливання щільності заряду, який існує на межі між провідником, зазвичай металом, та діелектриком. У золоті чи сріблі вільні провідні електрони поводяться майже як рідина, і коли світло певної частоти потрапляє на метал, воно може змусити ці електрони перейти до узгодженого, хвильового руху, що обіймає інтерфейс. Ця хвиля називається поверхневим плазмоном, оскільки це змішаний випромінюваний процес, що поєднує коливання електронів із електромагнітним полем світла. На відміну від звичайних світлових хвиль, цей плазмонний хід є незгасним, тобто його інтенсивність експоненційно спадає, коли ви віддаляєтесь від металевої поверхні в будь-якому напрямку, а не вільно поширюється у просторі. Незгасне поле розповсюджується лише на кілька сотень нанометрів над металевою поверхнею, що й пояснює чутливість SPR до того, що відбувається дуже близько до поверхні та її практичну нечутливість до будь-чого далі. Для збудження плазмону світлом необхідно задовольнити певне узгодження імпульсу, оскільки плазмони, що рухаються по плоскій металевій поверхні, природним чином несуть більше імпульсу, ніж фотони тієї ж енергії, що проходять через діелектрик. Звичайне світло, падаючи на плоский золотий фільм з повітря чи розчину, не може безпосередньо збуджувати плазмон через це невідповідність імпульсу. Дослідники вирішують цю проблему за допомогою методів зв’язування, найчастіше скляного призму, яка ефективно сповільнює світло та збільшує його імпульс вздовж інтерфейсу до тих пір, поки він не відповідає плазмону. Як тільки узгодження імпульсу досягнуто, енергія ефективно передається від вхідного світла у плазмонний хід, і це фіксується як різкий спад інтенсивності світла, що відбивається від металевого фільму, спостерігається при дуже певному куті або довжині хвилі.

Конфігурація Кретьчмана

Найбільш поширеною практичною конфігурацією для стимулювання поверхневих плазмонних коливань у лабораторії є конфігурація Кретьчмана, названа на честь фізика, який описав її в кінці 1960-х років. У цій установці тонкий золотий плівчастий шар, зазвичай товщиною близько п'ятдесяти нанометрів, відкладений безпосередньо на плоскій поверхні скляного призма з високим показником заломлення. Світловий промінь, як правило, лазерний, спрямовується в призму так, щоб він вражав золотий шар знизу, з боку скла, під кутом, більшим за критичний кут для повного внутрішнього відбиття. Оскільки світло проходить через щільний скляний призм перед досягненням металу, воно набуває точно необхідної додаткової імпульсу для відповідності хвилі поверхневого плазмону на протилежному боці шару, що відкритий повітрям або водній зразку. Коли кут падіння змінюється в вузькому діапазоні, при певному куті, який називається резонансним кутом, надходючий світловий промінь майже ідеально пов'язується з поверхневим плазмоном, і інтенсивність відбитого світла, що повертається з призми, різко падає, створюючи характерний спад у графі залежності відбиття від кута. Замість сканування кута деякі інструменти тримають кут незмінним і замість цього сканують довжину хвилі світла для пошуку резонансної умови; обидва підходи досліджують одну й ту саму основну фізику. Точне розташування цього спаду резонансу є прямим, чутливим вимірюванням показника заломлення середовища, що знаходиться над золотим шаром, на стороні, орієнтованої від призма, де і розміщується біосенсорна поверхня з іммобілізованими рецепторними молекулами. Ця геометрія майстерно розділяє оптичний шлях стимулювання, через скляний призму, від вимірювальної поверхні, що знаходиться під водним зразком, дозволяючи безперервний, реальний час моніторинг при обміні розчинів над золотим шаром.

Від Оптики до Біосенсорів

Перетворення цього оптичного явища на практичний біосенсор потребує способу селективної фіксації цільових молекул безпосередньо на золотій поверхні, в межах відносно неглибокого евагентного поля, де плазмон чутливий до змін показника заломлення. Вчені досягають цього шляхом хімічної функціоналізації золотого покриття тонким органічним шаром, часто самоасаміруваною монокшею (SAM), до якої кovalentно прикріплюються рецепторні молекули, такі як антитіла, рецепторні білки, ДНК-ланцюги або аптамери. Потім зразковий розчин, що містить потенційного партнера для зв'язку – аналіт, – безперервно подається через цю функціоналізовану поверхню всередині невеликого флюїдного каналу. Коли молекули аналіту в розчині розпізнають і зв’язуються з іммобілізованими рецепторами, накопичується маса на поверхні, і оскільки біомолекули зазвичай мають вищий показник заломлення, ніж навколишній водно-сольовий буфер, цей локальний приріст маси підвищує показник заломлення в евагентному сенсорному об’ємі. Це зміна показника заломлення викликає зсув кута резонансу до трохи більшого значення, і інструмент безперервно відстежує цей кутовий зсув, створюючи трацію у реальному часі, відому як сенсорграма, яка графічно зображає сигнал резонансу проти часу. Зі збільшенням кількості зв’язаного аналіту під час ін’єкційної фази сигнал зростає; коли аналіт-містить розчин замінюють на чистий буфер, раніше зв'язані молекули починають дисоціювати, і сигнал знову падає. Оскільки фізична основа виявлення полягає просто у зміні показника заломлення, спричиненій накопиченням маси, не потрібна флуоресцентна мітка, радіоактивний етикет або вторинний антитіл для детекції, що відрізняє SPR від багатьох інших загальних біохімічних аналізів. Ця безміткова, реальна швидкість є тим, що робить SPR унікально потужною для вивчення фундаментальної фізичної хімії молекулярних взаємодій, коли вони відбуваються, а не лише вимірювання кінцевого результату після завершення реакції.

Вилучення Кінетичних Параметрів

Реальна аналітична потужність біосенсору SPR походить від форми сенсорграми, яка кодує не тільки те, чи зв'язуються дві молекули, але й як швидко вони асоціюються та як швидко вони пізніше дисоціюють. Під час фази ін’єкції, коли аналіз протікає першим по поверхні датчика, сигнал підіймається у вигляді кривої, нахил якої залежить від константи асоціації, часто записованої як k_on, яка описує, як швидко вільні молекули рецептора та аналізу знаходять один одного та утворюють комплекс. Спостережувана швидкість збільшення сигналу залежить як від цієї внутрішньої константи асоціації, так і від концентрації аналізу в розчині, тому дослідники зазвичай повторюють експеримент при різних концентраціях аналізу, щоб відокремити ці внески математично. Після завершення ін’єкції та коли по поверхні тече лише буфер, зв'язані комплекси починають розпадатися, і сигнал зменшується відповідно до константи дисоціації, або k_off, яка відображає стабільність утвореного зв’язаного комплексу незалежно від концентрації. Відношення цих двох констант дає константу дисоціації рівноваги, зазвичай скорочено K_D, єдине число, яке підсумовує загальну привабливість між двома молекулами; менше значення вказує на сильнішу, тіснішу взаємодію. Оскільки SPR безпосередньо вимірює обидва швидкості за допомогою форми кривих, а не виводить привабливість лише з кінцевої точки рівноваги, воно надає значно більше механічної інформації, ніж простіші методи визначення зв’язування. Ці кінетичні деталі мають величезне значення в таких галузях, як відкриття ліків, де корисність кандидата часто залежить не тільки від того, як довго він залишається зв'язаним із своїм мішенню, керованим константою дисоціації, але й від того, наскільки сильно він зв’язаний загалом. Лікарські дослідники звичайні використовують прилади SPR для ранжування кандидатів у вигляді ліків за їхніми кінетичними профілями зв'язування проти терапевтичного білкового мішені, надаючи пріоритет сполукам із повільною константою дисоціації для подальшого розвитку.

Практичні Міркування та Обмеження

Незважаючи на свою потужність, біосенсор SPR має практичні обмеження, якими необхідно керуватися дослідниками для отримання достовірних даних. Оскільки метод чутливий до будь-яких змін показника заломлення поблизу поверхні, а не лише до специфічних зв’язків, неспецифічні взаємодії, коливання температури та навіть незначні відмінності у складі буферу між зразком і опорною розчином можуть вносити спотворення у сенсорграму. З цієї причини експерименти майже завжди включають опорну поверхню, підготовлену без специфічного рецептора або заблоковану для запобігання специфічним зв’язкам, щоб можна було відняти внески неспецифічних сигналів з експериментального каналу. Масові зміни показника заломлення, спричинені просто переходом від одного буферу до іншого, також можуть викликати різкі стрибки сигналу на початку та кінці ін’єкції, які необхідно розрізняти від справжнього сигналу зв’язування, процес, який називається «референсуванням» або відніманням нульового значення. Ефекти транспорту речовин представляють собою ще одну тонкість: якщо аналітичні молекули зв’язуються з поверхнею швидше, ніж свіжа аналітна речовина може дифундувати з масової розчини для заміни її, спостережувана швидкість асоціації відображає межі дифузії, а не справжні молекулярні кінетичні параметри зв’язування, тому необхідно ретельно вибирати витрати та концентрацію аналітичного речовини. Метод найкраще працює для взаємодій із відносно великою зміною маси, оскільки дуже маленькі молекули, що зв’язуються з поверхнею, створюють лише невеликий зсув показника заломлення, який важко відрізнити від шуму; спеціалізовані конструкції приладів та ретельна хімія поверхні допомагають розширити чутливість до менших аналітичних речовин. Нарешті, щільність і орієнтація іммобілізованих рецепторних молекул на золотій поверхні сильно впливають як на доступну місткість зв’язування, так і на видимі кінетичні параметри, які спостерігаються, тому протоколи підготовки поверхні є критичною, часто недооціненою частиною отримання достовірних даних SPR.

Frequently asked questions

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Surface Plasmon Resonance: Watching Molecules Bind in Real Time і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.