Кислотно-лужна рівновага

Як Хофмейстер побудував серію

Франц Хофмайстер вивчав явище розпушення та осадження білків яєчного жовткова, коли помітив дивовижне: ідентичність солі, а не лише її концентрація, визначала, чи залишалися білки у розчині, чи збиралися в осадок. Замість того, щоб вважати це шумом, він систематично змінював аніон та катіон у десятках солей і вимірював необхідну кількість для осідання певної кількості білка. Отриманий порядок аніонів, який досі цитується, приблизно такий: цитрат, сульфат, фосфат, більший за піроват, більший за хлорид, більший за нітрат, бромат більший за йодид, більший за ціїанід. Іони зліва потребують дуже мало солі для осідання білка і називаються «виключенням розчину» або «космотропними» (створюючими структуру) видами. Іони справа вимагають значно більших концентрацій, або навіть збільшують розчинність білка, і називаються «розриваютьчі структури» або «хаотропними» (руйнівниками структури) видами. Загалом існує паралельний, слабший катіонний ряд, часто записаний як аміак, калію, натрію, більший за літієм, магнієм, кальцієм, гвіанідієм. Що зробило це відкриття вражаючим, так це його відтворюваність. Той самий відносний порядок з'являвся знову і знову, незалежно від того, чи осідала білок яєчного альбуміну, чи вимірювався набряк желатину, або пізніше дослідники аналізували повністю різні білки, колоїди, навіть поверхневий натяг води. Це узгодженість у таких різних системах свідчила про те, що ефект не був дивом однієї конкретної білкової молекули, а й залежав від фундаментальної хімії іонів. Варто зазначити, що аніони загалом демонструють більш сильний та послідовний ефект Хофмейстера, ніж катіони, що натякає на остаточне, більш нюансоване пояснення, яке передбачає прямі взаємодії між іонами та зарядженими або поляризованими групами на поверхні макромолекули. Оригінальні 1888 роки Хофмейстера, опубліковані в німецьких фармацевтичних журналах, описували десятки ретельних титрувань осідання, і його рейтинг виявився достатньо стійким, щоб він продовжував відтворюватися в сучасніх лабораторіях з майже ідентичним відносним порядком, незважаючи на те, що білки, буфери та інструменти, які використовуються сьогодні, були б нерозпізнаваними для нього.

Класичне пояснення: формування та руйнування структури великої води

Приблизно протягом століття після експериментів Хофмейстера домінуючим поясненням було ідея про структуру великої води. За цією теорією, космотропні іони сильно гідратовані: вони міцно зв’язують молекули води та, роблячи це, підсилюють існуючу мережу водневих зв’язків у навколишньому розчині. Оскільки ці іони

забирають

воду та стабілізують її структуру, вони залишають менше 'вільної' води для гідратації та розчинності розчинених білків, ефективно стискаючи білкові молекули та сприяючи їх осадженню. Хаотропні іони вважалися, що працюють в протилежному напрямку. Будучи великими, слабко гідратованими та часто поляризованими (тіоцианід та йодид є класичними прикладами), вони вважалися, що порушують мережу водневих зв’язків великої води, роблячи її більш безладною або 'розбитою'. Це порушення нібито збільшувало здатність води гідрувати білки, утримуючи їх у розчині та навіть розгортаючи їх при достатній концентрації. Цей механізм формування та руйнування структури мав реальний пояснювальний потенціал. Він логічно пов’язаний з іншими властивостями іонів, такими як коефіцієнт В-відомісности Джозеса-Дола, який вимірює, як іон впливає на в'язкість води, та з вимірами зміни ентальпії гідратації. Космотропи зазвичай мають від’ємну зміну ентальпії гідратації та незначно збільшують в’язкість розчину; хаотропи мають позитивну зміну ентальпії гідратації і можуть незначно зменшити в'язкість. Ці кореляції здавалися підтверджувати ідею про те, що іони діють на молекули води далеко за межами їхньої безпосередньої координаційної сфери, справді тривалий-далекобічний ефект, який поширюється через мережу водневих зв’язків. Модель великої структури домінувала в підручниках протягом десятиліть і все ще викладається як перше наближення, оскільки вона дає студентам інтуїтивне уявлення. Однак, зі збільшенням кількості спектроскопічних інструментів, здатних безпосередньо досліджувати динаміку води в молекулярному масштабі часу, що стали доступними починаючи з 1990-х і 2000-х років, це уявлення почало руйнуватися під час більш детального вивчення, що заклало основу для значного перегляду розуміння цієї галузі.

Що насправді виявила УФ-спектроскопія

Ключовим моментом стало використання методів, здатних спостерігати за одноманітним переорієнтацією молекул води на фемтосекундному та пікосекундному рівнях, зокрема, ультрашвидкої інфрачервоної помпової-пробовної спектроскопії та вимірювань феморального оптичного ефекту Kerr, які були започатковані такими дослідниками, як Хуй Ба́ккер, Річард Сейккалі та інші в 2000-х та 2010-х роках. Ці експерименти вимірюють наскільки швидко мережа водневих зв’язків води розслаблюється та переорієнтовується після впливу, даючи прямий показник того, чи змінює іон структуру води в масовому обсязі, далеко від себе. Результати були неочікуваними. Навпаки класичній моделі, більшість іонів, включаючи сильні космотропи, як сульфат, впливали на переорієнтацію лише молекул води в їхньому безпосередньому першому гідратаційному шарі, зазвичай лише на один або два молекулярних шари. За приблизно один нанометр від іону масова вода не зазнавала змін динаміки, була невідрізною від чистої води. Це суперечило ідею про те, що космотропні іони якось досягають далеко розташованої води та переорієнтовують її. Якщо іони не змінюють структуру масової води на великих відстанях, то інше має пояснити, чому сульфат утворює білки, а тиоцинат їх розчиняє. Зростаюча картина, розроблена за допомогою робіт дослідників, таких як Пол Кремер, Павел Юнґвірц та інші, вказує на прямі, специфічні взаємодії між іонами та власною поверхнею макромолекули, зокрема її амінокислотним ланцюгом, зарядженими боковими ланцюгами та тонким гідратаційним шаром, що безпосередньо оточує її. Хаотичні аніони, як тиоцинат і йодид, великі, м’які та поляризовані, тому вони можуть сприятливо адсорбуватися на слабкополярних або гідрофобних ділянках білкової поверхні, ефективно стабілізуючи їх у розчині. Космотропні аніони, як сульфат, маленькі, сильно гідратовані та практично виключені з білкової поверхні; це виключення (іноді називане переважним гідратацією або ефектом виключеного об’єму) підвищує ефективну концентрацію білка відносно води та спонукає його мінімізувати площу поверхні шляхом агрегації та утворення осаду. Важливо зазначити, що це не вирішене питання. Різні дослідницькі групи все ще підкреслюють різні баланси між термодинамікою виключеного об’єму, прямим зв'язуванням іонів, поверхнево-напружуючими ефектами та залишками внеску води, і відносна важливість кожного механізму може змінюватися в залежності від конкретного білка, його поверхневої хімії та розчинових умов. Зараз загальноприйнято те, що стара, проста історія вигину масової води структурою іонів на великих відстанях є, принаймні, незначним внеском для більшості іонів, а домінуюча фізика значно локалізованіша, ніж це уявляли сусіди Хофмейстера.

Крісталізація та очищення білків: практичний досвід

До появи механізму, хіміки вже використовували серію Гофмейстера емпірично, і цей практичний досвід залишається ключовим для лабораторної роботи сьогодні. Випадіння амоній сульфату є однією з найпоширеніших технік очищення білків у світі: сульфат знаходиться близько до сильно космотропного кінця серії аніонів, а амоній – відносно космотропний катіон, тому амоній сульфат надзвичайно ефективно вилучає білки з клітинних вилог. Хіміки використовують це, додаючи амоній сульфат у контрольованих етапах, спочатку випадаючи небажані білки при нижчих концентраціях, а потім випадаючи білок, який цікавить, при вищій концентрації, – цю техніку називають роздільним або диференційним кристалізацією. При крісталізації білків скринінг-набори свідомо включають широкий спектр солей Гофмейстера, від сильно космотропних сульфатів і фосфатів до більш хаотропних тиоціанатів і нітратів, оскільки різні білки найкраще кристалізуються за різних точок серії. Космотропний сіль може бути потрібен для м’якого зниження розчинності білка лише настільки, щоб утворилися впорядковані кристали замість безладної аморфної преципітації, тоді як дещо більш хаотропні умови можуть знадобитися для білка, схильного до надмірного згортання. Кристалографи регулярно перевіряють десятки умов, що охоплюють серію, саме тому немає способу заздалегідь передбачити, яка точка спрацює для нового білка. У хроматографії колонки із гідрофобної взаємодії (HIC) безпосередньо покладаються на поведінку Гофмейстера: білки завантажують у м’яку гідрофобну смолу в буфері з високою космотропністю солі, що змушує гідрофобні ділянки білка прикріплюватися до смоли, а елюція досягається просто шляхом зниження концентрації солі, – це застосування, яке по суті є контрольованим, зворотним вилученням білків з використанням солі, що виконується на колонці замість у пробірці. Нарешті, при формуванні фармацевтичних препаратів розуміння того, де знаходиться сіль екцепієнта або стабілізуючої добавки в серії Гофмейстера, допомагає виробникам вибирати інгредієнти, які підтримують складену та розчинність терапевтичних білків, таких як моноклональні антитіла, під час зберігання та транспортування, запобігаючи агрегації, яка може знизити ефективність або спровокувати імунну реакцію у пацієнтів. Екцепієнти, такі як цукроза, трегалоза та певні буферні солі, обираються частково на основі їх відомого положення в серії або кореляції з нею.

Вибір Правильної Солі: Практичний Підхід

Для біохіміка, який вирішує, яку сіль використовувати, серія фон-Хейштедтера пропонує надзвичайно корисне правило, навіть без повного механічного пояснення. З багатьох років лабораторного досвіду сформувалося кілька практичних рекомендацій. Коли метою є концентрування або осадження білка без його денатурації, космотропні солі, розташовані близько до сульфатів і фосфатів у серії, є першим вибором. Амоній сульфат особливо популярний завдяки своїй високій розчинності (що дозволяє досягти дуже високої іонної сили), низькій ціні та відсутності негативного впливу на більшість голковидних білків, рідко викликаючи незворотне розгортання навіть при майже насичених концентраціях. Коли метою є підтримка білка в розведеному стані або порушення небажаних білок-білкових та білок-нуклеїнової взаємодій, хаотропні солі чи добавки, такі як цианід натрію, хлорид гуанідіну або сера (яка поводиться подібно до хаотропа, хоча й не є простою сіллю), використовуються. Хлорид гуанідіну особливо є універсальним хаотропним денатуратором, який використовується для розгортання та розчинення включнотілевих білків під час протоколів рефолдингу рекомбінантної білки. Коли потрібна нейтральна, фізіологічно сумісна іонна сила, хлорид натрію є першим вибором, саме завдяки своєму розташуванню в центрі серії та мінімальному впливу фон-Хейштедтера, що мінімізує небажані ефекти «засолювання» або «висолювання», але водночас забезпечує необхідну іонну силу для екранування електростатичних взаємодій. Важливо також пам’ятати, що серія може дещо змінюватися або навіть частково перевертатися для невеликої кількості білків, залежно від заряду та поверхневої хімії конкретної макромолекули, особливо поблизу її ізоелектричного точки. Це саме той тип поведінки, специфічної для білка, який передбачає сучасну модель локальних взаємодій, а не стару модельbulk-води, оскільки власна поверхнева хімія білка, а не лише розчинника, визначає наскільки сильно даний іон взаємодіє з ним. Через цю варіативність більшість досвідчених протоколів все ще вимагають емпіричного скринінгу по всій серії замість сліпої залежності від текстового порядку, розглядаючи ранжування фон-Хейштедтера як добре обґрунтований стартовий пункт, а не як абсолютне правило.”]} ⁇ ️‍🩹 𝕔𝖔𝖒𝖊 𝖗𝖎𝕘𝖍𝖙 𝖘𝖆𝖑𝖙: 𝖉𝖗𝖆𝖭𝖙𝖎𝖈𝖆𝖑 𝖦𝖗𝖆𝖒𝖒𝖆𝖙𝖎𝖐𝖆

Часті запитання

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте The Hofmeister Series: Why Salts Make or Break Proteins і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.