Реплікаційна стружка ДНК: Копіювання геному з високою швидкістю

Геліказа та розкручування подвійного спираля

Реплікаційний риф починається з гелігази – ферменту, який діє як молекулярна застібка, що працює в реверсі. Він рухається вздовж ДНК, розриваючи водневі зв’язки між спарованими базами та фізично відокремлюючи два скручені одноланцеві ланцюги подвійного спираля. Це розкручування створює характерну Y-подібну форму рифу, виявляючи дві окремі нитки ДНК, які будуть кожною слугувати шаблоном для нової комплементарної нитки. Однак відокремлені ниткоподібні ланцюги не є природно стабільними самостійно: відкриті одноланцеві ділянки схильні до повторного з’єднання у спіраль, утворюючи випадкові вторинні структури або атакуватися нуклеазами. Саме тут на допомогу приходять білки, зв’язуючі однеланцеву нитку (БЗН). Ці білки покривають відразу після гелігази виявлені одноланцеві нитки, тримаючи їх розділеними в розширеному, доступному конформі. Запобігаючи з’єднанню ланок назад, БЗН забезпечують наявність шаблонів ДНК для того, щоб полімеразу могла прочитати та скопіювати їх точно. Разом геліказа та білки, що зв’язують однеланцеву нитку, перетворюють стабільну, скручену подвійну спіраль на відкритий робочий шаблон, рухаючись попереду решти механізму реплікації та встановлюючи темп для всього, що відбувається на рифі.

Правило однієї спрямованості ферменту ДНК полімерази

ДНК-полімераза, фермент, відповідальний за фактичне побудову нових ниток ДНК, працює відповідно до суворої та негнучкої правила: вона може додавати лише нові нуклеотиди до ростучої ланцюга в напрямку від п’яти-кінця до три-кінця. Кожна нитка ДНК має хімічну спрямованість, з п’яти-кінцевим та три-кінцевим концом, і полімераза може лише подовжувати нитку шляхом приєднання нового нуклеотиду до три-кінцевого кінця існуючої ланцюга. Вона не може працювати у зворотньому напрямку і не може розпочинати нову нитку з нуля; вона може лише додавати на вже існуючий фрагмент нуклеїнової кислоти. Це обмеження може здатися незначною технічною деталлю, але має величезні наслідки для того, як відбувається реплікація. Оскільки дві нитки подвійного ланцюга йдуть антипаралельно одна до одної, одна нитка орієнтована таким чином, що полімераза може безперервно рухатися по ній в тому ж напрямку, що й відкривається вірід. Інша нитка орієнтована у протилежному напрямку, і на цій другій нитці полімераза може працювати лише короткими імпульсами, віддаляючись від вірного кожного разу, перш ніж повертатися назад. Це єдине правило – що синтез завжди відбувається від п’яти-кінця до три-кінця – є причиною майже всіх асиметрій, які спостерігаються на реплікаційному віріді, і розуміння цього правила є ключем до розуміння того, чому реплікація виглядає так по-різному на двох нитках.

Лідерні та відстаючі нитки: Історія про дві стратегії

Через обмеження 5'-3' (п’ять-три), дві нові ДНК нитки синтезуються кардинально різними способами. Лідерна нитка – щасливчик: її матриця орієнтована так, що полімераза ДНК може просто йти за хелазою безперервно, утворюючи одну довгу, нерозривну нитку, коли розширюється форвардний відгалуження. Відстаюча нитка, однак, має свою матрицю, яка працює в протилежному напрямку відносно руху форвардного відгалуження, тому полімераза не може просто йти за ним. Замість цього вона працює назад, короткими, повторюваними імпульсами, утворюючи серію дискретних фрагментів, що називаються фрагментами Окацакі. Коли розширюється форвардний відгалуження достатньо, щоб відкрити нову матрицю, полімераза синтезує ще один фрагмент, віддаляючись від форвардного відгалуження, а потім зупиняється та починає знову ближче до нього для наступного. У людей ці фрагменти відносно короткі, зазвичай приблизно 100-200 нуклеотидів завдовжки, порівняно з більш довгими фрагментами, які зустрічаються в деяких бактеріях. Після завершення фрагменту потрібно фізично з’єднати його з попереднім фрагментом, і ця робота покладається на ДНК лігазу, яка закриває розриви в цукро-фосфатному ланцюгу між сусідніми фрагментами Окацакі, зшиваючи їх у одну безперервну нитку. Таким чином, відстаюча нитка будується незв’язно та перебирається після того, як форвардне відгалуження розшириться, тоді як лідерна нитка просто продовжується в одній плавний русі.

Примаза: Надаючи Полімеразі Початок

Є одна особливість у правилі спряженості для ДНК-полімерази, яка робить додатковий фермент абсолютно необхідним: полімераза може лише подовжувати існуючу нитку, вона не може починати її з нічого. Кожна нова ДНК-нітка потребує короткого стартового фрагменту, на який можна «прилипнути», і цей стартовий фрагмент надається примазою – ферментом, що синтезує короткі ділянки РНК, які називаються праймерами. Примаза зчитує виявлену однолангову шаблону та укладає відповідну РНК-послідовність, створюючи вільний трипріорний кінець, який ДНК-полімераза може розпізнати та подовжити за допомогою ДНК-нуклеотидів. На лідиній нитці це потрібно зробити лише один раз, на самому початку реплікації для цієї нитки. Однак на комплементарній нитці примаза повинна діяти повторно, укладаючи свіжий РНК-праймер на початку кожного окремого фрагменту Оказакі, оскільки кожен фрагмент синтезується незалежно і потребує свого стартового пункту. Ці РНК-праймери тимчасові: вони пізніше видаляються та замінюються ДНК іншими ферментами відновлення перед тим, як ДНК-лігаза закриває проміжки. Без безперервної роботи примази на комплементарній нитці синтез неповних фрагментів Оказакі просто не міг розпочатися, що робить примазу непомітним, але незамінним партнером для ДНК-полімерази.

Призначено для швидкості та надзвичайно мало помилок

Що робить реплікаційну вилку справді вражаючою, це поєднання швидкості та точності, які вона досягає одночасно. У людських клітинах вилки реплікації рухаються приблизно з 50 нуклеотидами на секунду, що значно повільніше, ніж приблизно 1000 нуклеотидів на секунду, яке спостерігається у бактерій, але все ще представляє собою значний темп, коли множиться на тисячі вилок реплікації, які одночасно працюють вздовж наших хромосом. На цій швидкості копіювання всього геному все ще займе багато часу від однієї початкової точки, тому людські хромосоми містять багато точок початку реплікації, кожна з яких породжує пару вилок, які працюють паралельно, щоб завершити роботу за кілька годин, а не днів. Швидкість сама по собі була б небезпечною без точності, і ДНК-полімерази пов’язують синтез із вбудованою функцією перевірки, яка перевіряє кожен доданий нуклеотид та видаляє невідповідності перед продовженням. У поєднанні з додатковими системами виправлення невідповідностей, які сканують завершений ланцюг після цього, загальна кількість помилок після перевірки становить приблизно 1 до 10 мільярдів пар основ, враховуючи, що людський геном містить приблизно три мільярди пар основ, це означає, що лише кілька незлагоджених помилок зазвичай проходять повз під час одного циклу реплікації, надзвичайний подвиг молекулярної точності, який виконується з високою швидкістю кожного разу, коли клітина ділиться.

Часті запитання

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте The DNA Replication Fork: Copying the Genome at High Speed і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.