CRISPR-Cas9: Молекулярні Ножиці Пояснені

Походження: бактеріальна імунна пам'ять

CRISPR означає Групова Регулярно Розміщені Короткі Послідовності Паліндромних повторів — короткі ДНК послідовності в бактеріях, які зберігають фрагменти минулих вірусних вторгнень. Коли той самий вірус атакує знову, бактерія транскрибує збережений фрагмент у керівний РНК, який веде білок Cas9 безпосередньо до відповідної вірусної ДНК та обрізає її: справжня адаптивна імунна система в одноклітинній організм. Це було виявлено в E. coli в 1987 році, але його функція не була зрозуміла доти, поки Франсіско Мохіка (2005) показав, що він відповідає вірусним послідовностям. У 2012 році Дженіфер Даудна та Еммануель Шарпантьє продемонстрували, що спрощена керівна РНК може направити Cas9 для обрізання будь-якої ДНК послідовності в пробірці — початок ери програмована редагування генів CRISPR, і відкриття принесло їм Нобелівську премію з хімії 2020 року.

Как Cas9 разрезает ДНК

Cas9 сначала сканирует ДНК в поисках PAM (протоспицевая прилегающая последовательность) — для часто используемого фермента SpCas9 последовательность 5'-NGG-3'. Если 20-нуклеотидная направляющая РНК соответствует ДНК-волокну рядом с PAM, она образует пару оснований и разводит двойную спираль. Затем две нуклеазы доменов, HNH и RuvC, каждый режет одну нить, создавая чистую двунаправленную перестанку. Что происходит дальше, полностью зависит от ремонтных механизмов клетки.

Guide RNA:  5'- AGCUAGCUAGGCUAUGCAUC -3'  (20 nt)
                            ||||||||||||||||||||
Target DNA: 3'- TCGATCGATCCGATACGTAG -5'
                                          NGG  ← PAM
            5'- AGCTAGCTAGGCTATGCATC    NGG -3'
                              ↑ Cas9 cuts here, 3 bp upstream of PAM

NJH vs HDM: дві шляхи ремонту

NJH (не-гомологічне з’єднання кінців) швидке, але схильне до помилок: клітина склеює пошкоджені кінці разом, часто вставляючи або видаляючи кілька парів нуклеотидів, що зазвичай порушує ген – це ‘відключення’. Воно обробляє приблизно 70-90% ремонтів у більшості клітинних типів. HDM (гомологічний спряжований ремонт) замість цього використовує донорську ДНК-шаблон, наданий дослідниками, з гомологічними ділянками, що відповідають цільовому сайту, для точного вставлення або заміни послідовності – це ‘вставка’ – на нижчій ефективності, зазвичай 5-50%. Більшість лабораторних досліджень використовують ‘відключення’; терапії, які потребують корекції конкретної мутації, все частіше вимагають складнішого шляху HDM.

Проектування дизайну, відхилення та далі Cas9

Оскільки людський геном містить приблизно NGG PAM кожні 8 нуклеотидів, більшість генів пропонують багато можливих сайтів цілей, які оцінюються за вмістом GC (найкраще між 40 і 70 %) та за прогнозованій подібність до відхилень в інших місцях геному – помилки, найближчі до PAM, мають найбільше значення. Для зменшення ризику розрізання в нецільові ділянки дослідники використовують високоточні варіанти Cas9, скорочені керовані лідери, спарені ніказази, які розрізають лише тоді, коли обидва партнери зв’язуються, або доставляють Cas9 як білок з обмеженим терміном дії замість ДНК. З 2016 року редактори баз об'єднують «мертвий» Cas9 із деаміназовою ферментом для зміни одного нуклеотида в ДНК без розрізання обох ланцюгів, а з 2019 року прайм-редагування поєднує ніказазу Cas9 із ревертною транскриптазою, що дозволяє «шукати та замінювати» редагування без необхідності донорської матриці.

Реальні застосування

У 2023 році Casgevy став першою схваленою FDA CRISPR-терапією, редагуючи власні стовбурові клітини пацієнта для активації фетального гемоглобіну та функціонально виліковуючи серповидку. CAR-T імунотерапії раку використовують CRISPR для блокування контрольних точок імунітету та впровадження рецепторів, що націлені на пухлини. У сільському господарстві негенномодифіковані культури CRISPR — посухостійне тверде зерно, гриби без бродячого кольору — не містять чужої ДНК. Діагностичні інструменти, такі як SHERLOCK, використовують пов’язані з Cas ферменти для виявлення патогенів, таких як COVID-19, з паперового смужки за 30 хвилин. Редагування зародовника людських ембріонів, демонстрація якого викликала суперечки у 2018 році, залишається незаконним у більшості країн; ця галузь проводить чіткий розгляд між лікуванням власних клітин пацієнта та успадкованими змінами для майбутніх поколінь.

Frequently asked questions

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте the simulation і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.