Хіроскоп: Вимірювання Оптичної Активності Молекул

Чому світло стає коловоронним поляризованим

Звичайне не поляризоване світло містить коливання електричного поля у всіх напрямках, перпендикулярних його напрямку руху. Лінійно поляризоване світло обмежує ці коливання єдиним фіксованим плоском, як мотузка, яку смикають вгору-вниз. Коловоронне поляризоване світло відрізняється ще більше: вектор електричного поля підтримує постійну довжину, але обертається стабільно навколо напрямку руху, прокладаючи спіраль у просторі, коли хвиля рухається вперед, подібно до нитки гвинта. Якщо поле обертається за годинниковою стінкою, коли дивитися на нього в бік що надходить променя, то таке світло називається правозаломленим коловоронним; якщо воно обертається проти годинникової стічки, то це лівозаломлене коловоронне. Будь-який промінь лінійно поляризованого світла можна математично побудувати як рівну суперпозицію компонентів правої та лівої коловоронної поляризації, що обертаються в протилежних напрямках, і це розкладання виявляється саме правиним лінсом для розуміння оптичної активності. Промінь ідеально коловоронного поляризованого світла сам по собі є химерним у геометричному сенсі, оскільки його спіральний візерунок поля не є суперпозиційним своєму дзеркальному відображенню, така ж властивість визначає хіральну молекулу. Ця спільна

ручність

між світлом і молекулою є точно тому, чому коловоронне поляризоване світло, а не звичайне лінійне або не поляризоване, є основним інструментом для виявлення молекулярної хіральності. У лабораторії виробництво коловоронного поляризованого світла зазвичай передбачає проходження лінійно поляризованого світла через квадровану пластинку, що розрізняє світло, або в сучасних приладах для циркоїсної дихроіміії – швидке електрооптичне модуляцію стану поляризації за допомогою пристрою, званого фотоеластичним модулятором, який перемикає промінь між правою та лівою коловоронною поляризацією тисячами разів на секунду, щоб можна було виміряти незначну різницю в поглинанні між цими двома станами проти інструментального шуму.

Чому хіральні молекули по-різному поглинають світло

Фізичне коріння колориметричної двоїстості полягає в тому, як електрони молекули реагують на обертаюче електричне поле спірнополярного світла. При поглинанні світла електрон переходить з одного квантового стану в інший, а ймовірність цього переходу залежить від того, наскільки сильно цей перехід пов'язаний як з електричною, так і з магнітною складовою хвилі світла. У нехіральної молекули просторова організація атомів має дзеркальну площину або інший елемент симетрії, що робить внески електричного та магнітного дипольних моментів переходу ефективно незалежними, тому ліво- та правозахирнополярне світло поглинаються однаково. У хіральної молекули такої симетрії немає: електронна структура, пов'язана з певним електронним переходом, простежує асиметричний, спіралеподібний шлях через тривимірну структуру молекули. Ця асиметрія означає, що перехід одночасно несе як електричний, так і магнітний дипольні моменти, які не є незалежними, але пов'язані між собою, величину якої математично визначають як обертову силу цього переходу. Оскільки спірнополярне світло само по собі має спіральну, закручену геометрію, воно ефективніше взаємодіє з переходом, чия електронна рухливість має таку ж закрученість, ніж з переходом із протилежною закруткою. В результаті одне спірнополярне світло поглинається дещо сильніше, ніж інше, зазвичай на різницю в кілька тисячних частин відносно загального поглинання. Колориметричну двоїстість повідомляють або як різницю в поглинанні між ліво- та правозахирнополярним світлом, або, більш поширено у старих, але все ще широко використовуваних конвенціях, в одиницях, які називаються міліградусами еліптичності, що описують, як початковий лінійно поляризований промінь стає дещо еліптичним після його проходження через зразок, оскільки два циркулярних компоненти атенюються нерівномірно.

Відбитки Вторинної Структури Білків

Найважливішим застосуванням циркулярної дихроїзму в структурній біології є використання того факту, що пептидна зв’язування за своєю природою є хиральним хромофором, коли воно вбудоване у складений білковий каркас. У далеко- ультрафіолетовій області, приблизно від 190 до 250 нанометрів, електронні переходи пептидного зв’язування створюють сигнали циркулярної дихроїзму, форму яких чутливо залежить від місцевої геометрії каркасу, зокрема, дієнральних кутів, які визначають, чи розташована ланцюг у вигляді альфа-спіралі, бета-листків або розрідженого випадкового колу. Альфа-спіраль створює дуже характерний спектр із двома негативними ямами поблизу 208 та 222 нанометрів і сильного позитивного піку близько 192 нанометрів, що виникає від регулярного повторного водневого зв’язування спірального каркасу. Бета-листи створюють єдину негативну яму поблизу 218 нанометрів і позитивний пік близько 195 нанометрів, який кардинально відрізняється за формою та менш інтенсивний, ніж спіральний малюнок. Розріджені області створюють дуже низьку еліптичність при довгих хвилях і сильний негативний пік нижче 200 нанометрів. Оскільки справжній білок є сумішшю цих локальних структурних елементів, його виміряний далеко- ультрафіолетовий спектр можна математично моделювати як лінійну комбінацію зважених орієнтовних спектрів чистої спіралі, чистого листа та чистого колу, що дозволяє обчислювально отримати приблизний відсоток кожного типу вторинної структури. Цей підхід не може розкрити атомно-розрядні деталі так, як це роблять рентгенівська кристалографія або ядерний магнітний резонанс, але він вимагає лише невеликої кількості білка в звичайному водному розчині, займає хвилини замість тижнів і підходить для білків, які вперто відмовляються кристалізуватися, роблячи його незамінною першою фазою структурної техніки.

За межами вторинної структури: ближньоінфрачервоне та кінетика

Хоча дальнє ультрафіолетове випромінювання повідомляє про вторинну структуру основного ланцюга, ближньоінфрачервове випромінювання, приблизно від 250 до 350 нанометрів, повідомляє про терійарне, тривимірне пакування білка, оскільки воно визначає місцеве хиральне середовище навколо ароматичних бокових ланцюгів, таких як триптофан, тирозин і фенилаланін, а також дисульфідні зв’язки. Добре складений, компактний білок зазвичай демонструє багаті, чітко визначені характеристики кругової дихроїзму у ближньоінфрачервоному діапазоні, оскільки його ароматичні зали утримуються в фіксованих асиметричних пакуваннях навколо структури. Якщо білок розгортається або слабо упакований, ці сигнали у ближньоінфрачервоному діапазоні згладжуються до нуля, навіть якщо ароматичні хромофори все ще присутні, оскільки втрачено впорядковане хиральне середовище, яке формувало сигнал. Це робить кругову дихроїзм надзвичайно зручним інструментом для моніторингу згортання та розгортання білків у реальному часі: оскільки повний спектр можна виміряти за кілька секунд чи хвилин, дослідники можуть відстежувати, як змінюються сигнали далекого та ближнього ультрафіолетового діапазону при зміні температури, pH або хімічного денатуранту, отримуючи криву розплаву, яка виявляє термодинамічну стабільність складеного стану та визначає, чи відбувається розгортання через видимі проміжні стани. Та сама швидкість і вимоги до малих зразків також роблять кругову дихроїзм цінним для спостереження динамічних процесів, таких як зв’язування ліганду, вставлення білків мембран у ліпідні бішари або агрегація білків у амілоїдні фибрили, процес, пов’язаний із кількома нейродегенеративними захворюваннями, де спектр змінюється від хелатного або коту структури до сигналу, що домінує в бета-схелах, коли накопичуються неправильно складені агрегати.

Фармацевтична Хіральність та Контроль Якості

Циркулярна дихроїзм відіграє однаково важливу, але дуже різну роль у фармацевтичній промисловості, де використовується для підтвердження та кількісного визначення хіральності невеликих молекул лікарських субстанцій, а не згинів білків. Багато лікарських молекул є хіральними, і їхні два енантиомери, хоча й майже хімічно ідентичні, можуть взаємодіяти дуже по-різному з хіральним середовищем людського тіла, оскільки біологічні рецептори, ферменти та транспортні білки самі складаються з хіральних амінокислот однією руки. У деяких відомих історичних випадках один енантиомер лікарського засобу забезпечував бажаний терапевтичний ефект, тоді як інший енантиомер був неактивним або, в рідкісних трагічних випадках, активно шкідливим, тому регуляторні органи тепер зазвичай вимагають суворого встановлення та контролю хіральної чистоти хірального лікарського засобу під час виробництва. Циркулярна дихроїзм, часто у поєднанні з оберненою високопродуктивною рідинною хроматографією, забезпечує швидкий, неруйнівний спосіб підтвердження того, що лікарська субстанція має правильну абсолютну конфігурацію та вимірювання її енантиомерного надлишку, тобто скільки однієї дзеркальної форми присутня відносно іншої, оскільки навіть процес синтезу, розроблений для виробництва одного енантиомеру, може випадково генерувати невелику кількість небажаної дзеркальної форми або дозволити їй рацемізуватися, тобто повільно перетворюватися назад до рівного змішування, під час зберігання. Оскільки сигнал циркулярної дихроїзму безпосередньо та передбачувано масштабується з енантиомерним надлишком для даної сполуки, виробники можуть будувати калібрувальні криві, які перетворюють звичайне спектральне вимірювання на кількісну оцінку чистоти, інтегровану безпосередньо в робочі потоки контролю якості, що повинні бути задовільнені перед затвердженням фармацевтичного продукту для продажу.

Часті запитання

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Circular Dichroism: Reading Molecular Handedness with Light і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.