Органоїди та 3D біологічні моделі

Вступ до органоїдів

Органоїди – це самоорганізуючі тривимірні тканини, що вирощуються в гелях екстрацелюлярної матриці (зазвичай Matrigel або синтетичні аналоги) з використанням дорослих мезенхімальних стовпчастих клітин або пупових стовбурових клітин (ембріональних чи індукованих пуповими стовбуровими клітинами – iPSCs), які відтворюють ключові структурні та функціональні ознаки їх походження. Концепція органоїдів була сформульована лабораторією Ганса Клеверса, яка продемонструвала, що окремі Lgr5+ кишечні стовпчасті клітини можуть самоорганізуватися в самовідтворювальні структури крипто-вілл, що імітують кишкові органоїди, у Matrigel з визначеними коктейлями факторів росту (EGF, Noggin, R-spondin1), відтворюючи архітектуру кишечника безперервно *in vitro*. Цей прорив спричинив вибух в органоїдних системах, що представляють практично кожний основний орган – мозок, печінка, нирки, підшлузна залоза, легені, колон, простати, ендометрій, сітківка та інші. Трансформаційний потенціал органоїдів полягає в їх перевазі над двовимірними клітинними лініями для відтворення специфічної для органу біології: органоїди підтримують архітектуру тканини, забезпечуючи правильну полярність клітин, клітинно-клітинні з’єднання та геномні моделі, що відповідають організму, які втрачаються у двовимірній культивуванні; вони містять кілька типів клітин у фізіологічно значущих пропорціях (на відміну від одношарових моношарів з однієї клітинної лінії); їх можна безперервно розширювати, що дозволяє створити банк даних для персоналізованої медицини; та органоїди, отримані від пацієнтів, зберігають генетичні та молекулярні характеристики пухлини або захворювання пацієнта, що дозволяє проводити тестування чутливості до ліків. Органоїдні банк даних з пацієнтів, які отримують хіміотерапію, краще прогнозують клінічну відповідь на ліки, ніж клітинні лінії – з кореляцією понад 80% між чутливістю органоїда до ліків та клінічними результатами у раку товстої кишки, яєчника та підшлункової залози.

Органоїди мозку

Органоїди мозку, також відомі як церебральні органоїди, – це платформа, що дозволяє генерувати структурно складні структури, подібні до мозку, з використанням людських iPSK (іподермальних стовбурових клітин) із збереженням кортикальної організації, формування хоріоцепального залозу та електрофізіологічної активності. Протокол: ембрійди iPSK у ультранизькопритискних умовах формуються; інгібітори Wnt/BMP визначають нейровідповідність; перенесення в краплі Matrigel та спіннери дозволяє ротаційну культуру, що підтримує дифузію кисню та поживних речовин незалежно від васкуляризації; самоорганізація генерує радіально організовані ворітні зони, кортикальні області та підкореневі структури. Порівняння людських і шимпанзе церебральних органоїдів за допомогою видів-специфічних iPSK виявило відмінності у довжині циклу клітинного поділу в прогеніторах, що сприяли розширенню кори у людей. Моделювання захворювання мікроцефалії в органоїдах пацієнтів безпосередньо показало дефекти мітотичного пучкова у клітин MCPH1-мутованих, що пояснюють втрату об’єму кори.

Регіонально специфічні органоїди мозку

Використання спрямованих протоколів диференціації з використанням регіонно-специфічних морфогенних сигналів генерує органоїди, що нагадують певні ділянки мозку: органоїди хоріоцепального залозу (за допомогою високого BMP4) виробляють рідину, подібну до ЦФС, і функцію бар’єру крові та ЦФС; гіпоталамічні органоїди за допомогою пригнічення канонічного Wnt та активації Shh; середньомозкові органоїди з визначенням підлоги генерують дофамінергічні нейрони – використовуються для моделювання iPSK пацієнтів з хворобою Паркінсона; таламічні, гіпокампальні, мозкові та спинномозкові органоїди були повідомлені. Збірка органоїдів – об’єднання регіональних органоїдів мозку – дозволяє моделювати зв’язок між областями: злиття органоїдів передньої та задньої дорзильної ділянки генерує міграцію інгибуючих інтернейронів, що відтворює кортикогенез; стриато-коріальні асемблеї виявляють розвиток кори-стріального кола, дозволяючи моделювати екситоксичність хвороби Ганттона в людських тканинах.

Органоїди, отримані з пацієнта

Органоїди, отримані з пацієнта, можуть бути створені з біопсій пухлин, хірургічних резекцій або навіть циркулюючих пухлинних клітин – зберігаючи геномний ландшафт, фенотипову різноманітність та чутливість до ліків пацієнта краще, ніж усталені клітинні лінії. Панкреатична виразкова карцинома (ПВК) – історично не маючи хороших преклінічних моделей для високостійкого до лікування раку – тепер може підтримуватися у вигляді органоїдів з EUS-FNB (ендоскопічної ультрасонографії точкового біопсійного зондування), що дозволяє приймати індивідуальні рішення щодо лікування. Органоїди пухлин мозку, отримані з резекцій гліобластоми, зберігають інтенуальну неоднорідність та характеристики імуносупресивної мікросередовища. Органоїди уротеліальної карциноми, отримані з біопсій цистектомії, дозволили прогнозувати відповідь на хіміотерапію в клінічному дослідженні TUMOROID. Манчестерський реєстр органоїдів та подібні біобанки забезпечують ретроспективну та проспективну валідацію підходів персоналізованої медицини, заснованих на органоїдах, у масштабах.

Технологія «Органоїд» на мікрочіпах

«Органоїди» на мікрочіпах поєднують мікрофлюїдну інженерію з біологією клітин – вирощування клітин у мікромасштабних камерах із точно контрольованим тертям, механічним напруженням та інтерфейсами між клітинами, які неможливо досягти в статичних органоїдах. Робота Дона Інґбера в Wyss Institute створила «легеневий» органоїд на мікрочіпі (PDMS мікропристрій з людськими дихальними епітеліальними та ендотеліальніми клітинами, розділених еластичною мембраною, що циклічно розтягується для імітації дихання), який відтворює набряк легень, викликаний ліками від раку IL-2, та його зняття ангіопоєтіном-1 – результати, пізніше підтверджені в клінічних дослідженнях на людях. «Кишечний» органоїд, «печінковий» органоїд, «мозок» на мікрочіпі, «нирковий» органоїд та багатоорганні системи («тіло» на мікрочіпі) краще відтворюють *in vivo* властивості ADMET (поглинання, розподіл, метаболізм, виведення, токсичність) ліків, служачи людськими замінами для доклінічних досліджень і потенційно зменшуючи використання тварин.

Приклади та застосування

Приклад 1: Шлунковий Органоїд для скринінгу препаратів при ХСВ

Органоїди шлунка від пацієнтів з ХСВ (хвороба Крона, виразковий коліт) підтримують специфічні функції клітинного барьеру епітелію, відповідність цитокінам та сприйнятливість мікробіому – що дозволяє проводити скринінг препаратів на основі специфічних для пацієнта дослідів. Моношари органоїдів шлунка на транселл-платформах забезпечують вимірювання стійкості бар’єру (TEER) та аналіз бактеріального транспорту; органоїди, піддані впливу цитокінів, пов'язаних з ХСВ (TNF, IL-13, IFN-гамма), моделюють запалення слизової оболонки. Скринінг органоїдів на основі пацієнтів виявив, що органоїди від пацієнтів, які реагували на ведолузумаб (анти-алфа4бета7 інтегрин), показали специфічні імунномедіаторні відповіді бар’єру, що відрізняли реагуючих від нереагуючих. Відмінності у чутливості до ліків між підтипами макрофагів CD14hi та CD14lo, моделірованими за допомогою кокультур епітелію та макрофагів в форматі органоїда, допомагають зрозуміти специфічні для ХСВ підтипи лікування. Органоїди на основі мікробіому моделюють порушений мікробіомом-епітеліальний крос-розмов, що спостерігається при ХСВ.

Приклад 2: Підшлункова Органоїд Бета-клітин для діабету

Для отримання функціональних інсулінсекретуючої бета-клітин з людських iPSK необхідне розуміння сигналів розвитку специфікації підшлункової залози (визначена ендодерма → примітивний шлуночок → задній формінголовник → продирослини підшлункової залози → ендокринні продирослини → бета-клітини), кожен з яких керується різними коктейлями морковок (Activin/Wnt → фактор росту кератиноцитів + KAAD-циклопамін → ретиноїдний кислотний + ILV → нікотинамід + ексендин-4). Програма VX-880 від Vertex Pharmaceuticals, що базується на iPSK, трансплантувала клітини, отримані з стовбурових клітин, в пацієнтів з діабетом 1 типу через портальну інфузію печінки – ранні дані (2021-2023 рр.) показали інсулінонезалежність у багатьох пацієнтів, першу функціональну “виправку” діабету 1 типу від клітинної терапії. Оскільки всіogeneic iPSC-органіди потребують імуносупресії, iPSC-лінії з HLA-knockout + CD47/PD-L1 knock-in дозволяють трансплантацію без імуносупресії – протестовано до клінічних випробувань першої фази.

Приклад 3: Органоїд Синусної Залози у Розробці Генної Терапії

Органоїди синусової залози – отримані з iPSK за допомогою відтворення сигналів розвитку (BMP4 для синусної чашечки, FGF для ретикулярної тканини, CHIR99021 для ретикулярного епітелію) – містять стратифіковані шари фоторецепторів з утворенням сегментів зовнішньої оболонки, функціональні світлочутливі дистрофічні та палицевидні фоторецептори, які вимірюються електрофізіологічно, муцові клітини, гангліозні клітини та біполярні клітини. Органоїди синусової залози, отримані з iPSK від пацієнтів із сітковою дегенерацією (RP11, PRPF31; рахітис, USH2A; ДЦН, CEP290), відтворювали специфічні для захворювання дегенерації фоторецепторів та підтверджували AAV-генну терапію з порятунку – з AAV-RPGR порятували фоторецептори в органоїдах RPGR-RP, що прогнозує результати клінічних випробувань. Антисенс олігонуклеотидний перемикання сплитання для інтронного мутації CEP290 (Sepofarsen, EDIT-101) був валідований у людських органоїдах перед клінічними дослідженнями.

Приклад 4: Органоїди Печінки та Гепатотоксичність

Органоїди печінкових жоляків або органоїди, отримані диференціацією iPSC, використовуються для прогнозування гепатотоксичності (ДГТ) – основної причини вилучення препаратів після затвердження. 3D сферичні культури гепатоцитів підтримують життєздатність протягом 3-4 тижнів (на відміну від 48 годин для моноклітинних) та відновлюють активності CYP3A4/CYP2D6/CYP1A2, що наближаються до ін vivo рівнів – критично важливо для прогнозування гепатотоксичності, яка потребує активації препарату (троглітазон, диклофенак, фіялуридин токсичність вимагають біоактивації). Печінково-напіловий чіп з протікаючим середовищем забезпечує тестування хронічної низької концентрації ДГТ, яке не помічається в гострих високих дозах. Органоїди печінки від пацієнтів із захворюванням Уілсона з мутаціями ATP7B накопичують мідь відтворювано, що дозволяє оцінити ефективність хелатування та корекції гену. Органоїди жоляків від пацієнтів із атрезією жоVEльця моделюють дефект формування жоVEльця, опосередкований JAG1/Notch, що дозволяє проводити скринінг препаратів, спрямованих на диференціювання жоVEльця.

Приклад 5: Органоїди Нирок

Органоїди нирок, створені Джеймі Девісом та Меліссою Лайтл, містять нефри з проксимальним відростком, петлею Генле та клубочком із подкоркою та простором Боумена – хоча й без збирального протоку та міжтканинної речовини. Архітектура підкорки (подоцини, нефрин, експресія WT1) відтворює нормальну гломерулярну біологію. Органоїди нирок при полікістозному нефриті (PKD, мутації PKD1/PKD2) розвивають великі кишкові порожнини з проксимальних відростків, відтворюючи фенотип PKD in vitro. Інгібітори mTOR зменшують утворення кишок в органоїдах – що відповідає клінічним даним про лікування ADPKD. Тестування токсичності нирок в органоїдах краще прогнозує нефротоксичність цисплатину в 3,2 рази, ніж моноклітинні культури проксимальних відростків, покращуючи перехід з доклінічних досліджень у клінічні.

Приклад 6: Моделі Асемблей для Неврологічних Захворювань

Органоїди мозкової області – об'єднання окремо виготовлених дорсальних передніх, віпотальних передніх, гіпоталамічних та мозкових стовбурів – дозволяють моделювати багатообласні взаємодії при неврологічних захворюваннях. Лабораторія Сергіу Паска розробила асембле-органоїди кори-таламуса, де міжнуклеарні таламусу мігрують та синаптично інтегруються в корейні органоїди, відтворюючи розвиток кори-таламусної схеми – дефектні асембле-органоїди пацієнтів з розсіяним склерозом та шизофренією. Органоїди спинного мозку-м’язу моделюють утворення м’язово-нервового з’єднання; органоїди спинного мозку від пацієнтів з болковим миопатією показали селективне відривнення аксонів моторних нейронів від м’язових цілей перед смертю. Органоїди спинного мозку від пацієнтів із ретикулярним розладом (MECP2 мутації) виявили специфічне порушення міграції та інтеграції інгібуючих міжнуклеарних клітин у корейні схеми, що ідентифікують цитоархітектурну основу зміщеного балансу інгібіторно-стимулювального при ретикулярному розладі.

Приклад 7: Культура Трубочок для Відновлення Нирок

Культури трубок від клітин сечі або біоптату нирок – самовідтворювані культури, що збагачені типами проксимальних та дистальних трубок – підтримуються протягом кількох років як культури-резервуари для скринінгу препаратів та дослідження механізмів захворювань. Ключові застосування: біобанк трубок від PKD, нефронуфрозного нефриту, кислотно-лужної дисфункції нирок та інших трубних розладів для скринінгу препаратів і досліджень механізмів захворювань. Генна корекція мутацій PKD1 в органоїдах трубок за допомогою CRISPR відновила нормальну експресію PKD1 та зменшила утворення кишок, моделюючи потенційний підхід до генної терапії. Трансплантація трубочкових органоїдів в опікуні нирок або при впливі цисплатину продемонструвала початкове приживлення в перитубулярних місцях – що забезпечує потенційний клітинний терапевтичний підхід до гострого пошкодження нирок у пацієнтів на діалізі, які втратили функцію трубки нирок на діалізі.

Приклад 8: Моделювання COVID-19 в Органоїдах

Патофізіологію SARS-CoV-2 швидко вивчали за допомогою різних органоїдів після початку пандемії. Органоїди м’язів чоразової оболонки, уражені SARS-CoV-2, показали тропізм для клітин чоразової оболонки (високий ACE2 експрес) що призвело до порушення бар’єру – потенційно пояснюючи неврологічні ефекти при COVID-19. Органоїди легень, шлунково-кишкові органоїди, ниркові органоїди та судинні органоїди показали продуктивне зараження SARS-CoV-2, відтворюючи тропізм на основі експресії ACE2/TMPRSS2. Мозкові органоїди показали зараження SARS-CoV-2 в коретичних нейронах з запальними відповідями та клітинною загибеллю навіть за відносно низької вірусної концентрації – моделюючи COVID-пов’язані неврологічні симптоми. Скринінг препаратів за допомогою інфікованих органоїдів виявив кандидатів у вигляді антивірусів (ремедесивід підтвердив активність у багатьох органоїдах; каместат/фоіпан – TMPRSS2 інгібітори; моноклобальні антитіла, що нейтралізують інфекцію в дихальних органоїдах) до клінічних випробувань, демонструючи цінність органоїдів як інструментів для відкриття ліків під час пандемії.

Спробуйте онлайн

Все вище працює у вашому браузері — відкрийте симулятор росту органоїдів та відповіді на дії ліків і змініть параметри під час його роботи. Не встановлюється нічого, не завантажується нічого, весь модель живе в одному вікні.

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Organoid Growth & Drug-Response Simulator і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.