Оптогенетика та Нейроінженерія

Вступ до Оптогенетики

Оптогенetica поєднує генетику (виразження світлочутливих білків у конкретних нейронах) та оптику (доставка світла точним чином до мозкових цілей) для контролю нейронної активності з часовою точністю мілісекундного масштабу та специфічності щодо типів клітин, які неможливі за допомогою звичайного електричного стимулювання або фармакології. Початковий відкриття було демонстрацією Карлом Дейсертошем та його колегами (2005) того, що Каналродопсин-2 (ChR2), світлочутливий катіонний канал від одноклітинної водорості *Chlamydomonas reinhardtii*, може бути виражений у мишах та надійно активуватися імпульсами синього світла з часовою точністю, що відповідає природним ритмам спалювання нейронів. Це вирішило фундаментальну проблему неврології: розрізнення функціонального внеску конкретних, генетично визначених типів клітин у поведінку, сприйняття та хвороби.

Сфера швидко розширилася від початкового демонстрації ChR2: інгібуючі оптони (халородопсин, архіродопсин, інженерні каналородопсини) дозволяють приглушувати нейрони за допомогою світла; червонозміщені оптони (C1V1, ReaChR, ChrimsonR) забезпечують глибше проникнення в тканини та багатоколірні експерименти; оптони з функцією сходи можуть залишатися активними під впливом світлових імпульсів для тривалого модуляції; хеміогенetica (DREADDs – Рецептори, призначені для активації спеціально розродженими ліками) надає доповняльний підхід за допомогою генетично модифікованих рецепторів, що активуються фармакологічно неактивними лігандами. Разом оптогенetica та хеміогенetica трансформували системи неврології, дозволяючи проводити причинно-наслідкові дослідження нейронних лабіринтів, які лежать в основі поведінки, пам'яті, прийняття рішень, страху та мотивації.

Опсін Біологія та Відкриття

Тип I Опсіни (Мікробні Родопсини)

Каналродопсини (ChRs) – це білки-ізомерази/іонопроводи з подвійним функціоналом, що містять ковалентно зв’язаний хромофор альтранс-ретиналу в 7-трансмембранній альфа-спиралі, схожій на рецептори GPCR. Поглинання світла запускає ізомеризацію ретиналю з альтрансу на 13-цис конфігурацію, відкриваючи внутрішній катіон-провідний канал, що пропускає H+, Na+, K+, Ca2+. Кінетика ChRs визначає часову роздільну здатність – швидкі варіанти ChR2 (ChETA, мутація E123T) генерують імпульси на частоті 100 Гц; ультрашвидкий Chronos генерує імпульси на частоті 200+ Гц, що дозволяє керувати з точністю до мілісекунд. Інженерні варіанти: кальцієво-проникний CatCh для CICR; каналородопсини, орієнтовані на тіло нейрона, щоб мінімізувати світлове стимулювання аксонів; інгібуючі опсіни, орієнтовані на тіло. Структурна біологія (кріо-ЕМ структури ChR2, ChRmine, ChRger1) розкриває механізм відкриття каналу та спрямовує раціональне проєктування покращених варіантів.

Інгібуючі Опсіни

Галородопсин (NpHR, з Natronomonas pharaonis) – це світлозалежний насос Cl- – він поглинає жовте світло, щоб перекачувати Cl- в клітини, гіперполяризуючи нейрони. Архародопсин (Arch, з H. sodomense) – це насос H+, що забезпечує ефективну фотоінгібацію – обидва потребують безперервного доставки фотонів для підтримки інгібування (насоси, на відміну від каналів). JAWS (модифікований галородопсин) та інгібуючі опсіни, орієнтовані на тіло, покращують оптичну ефективність приглушення. Аніонні каналродопсини (GtACR1, GtACR2 з криптопітевих; штучно створений iC1C2) проводять Cl- при активації світлом, забезпечуючи справжні світлозалежні інгібуючі канали, більш ефективні за насоси. Однак, ACR можуть парадоксально викликати збудження немієлінованих аксонів, де ECl відносно деполяризоване – це важлива considerazione у дизайні експериментів та потенційних терапевтичних застосуваннях.

Методи доставки

Вектори на основі вірусів

Вектори на основі аденовірусу (AAV) є основним засобом доставки опсинів – стереотктично вводиться в цільові ділянки мозку, ефективно трансдукуючи сусідні нейрони протягом 3-6 тижнів. Специфічність щодо типу клітин досягається за допомогою промоторів, специфічних для певних типів клітин (CaMKII для екзогенних нейронів, GAD1 для гамма-амінобутової кислоти (GABA) інтернейронів, TH для дофаминових нейронів), або вектори, що залежать від Cre (двократно заінвертований ORF = конструкції DIO, які активуються лише в клітинах, що експресують Cre, з певних трансгенних мишей, що об'єднують генетичну специфічність із гнучкістю доставки вірусами). Вектори на основі ретроградного AAV (rAAV2-retro) та анотарадний трансинаптичний вірус дозволяють цілеспрямованому вираженню генів, спрямоване на нейрони, що проектуються до або з певної області. AAV9 і AAVphp.eB перетинають гематоенцефалічний бар’єр після системного введення, забезпечуючи неінвазивне експресування по всьому центральній нервовій системі (ЦНС).

Терапевтичні застосування

Оптогенетика перекладається на клінічну терапію. Ретинальна оптогенетика – вираження ChrіmsonR або інших опіонів у живих внутрішніх сітківчастих нейронах (біполярних та гангліозних клітинах) у пацієнтів з дегенеративними захворюваннями зору (ретиніт із запальним джерелом, старгарт), відновлює світлочутливість. Перше людське відновлення зору за допомогою оптогенетики (GenSight Biologics GS030, AAV-ChrimsonR у гангліозних клітинах + окуляри з підсилювачем світла) відновило деяку функцію зору у сліпого пацієнта з ретинопатією із запальним джерелом у 2021 році – перша успішна оптогенетична терапія у людей. Оптогенетика слухового нерва використовує швидші варіанти ChrR, які стимулюють волокна слухового нерва з кращою часовою точністю, ніж електричні кохлеарні імпланти, потенційно покращуючи розуміння мови в тиші та при шумі. Стимуляція мозку для лікування хвороби Паркінсона, депресії та епілепсії знаходиться на стадії доклінічних досліджень.

Приклади та Застосування

Приклад 1: Роз’єднання Кору Голомок Лабораторії Тонегави та Бхаскари використали оптогенетику, щоб довести, що енграми пам’яті (специфічні нейрони, які кодують пам’ять) є достатніми та необхідними для вираження пам’яті. Миші, навчені боятися тону, демонстрували повторне активування тих амігдалових і гіпокампальних нейронів, позначених під час навчання на страх, за допомогою використання cfos-tTA, який керував експресією опсина під час навчання (активозалежне маркування). Світлове повторне активування позначених гіпокампальних клітин у нейтральному контексті викликало параліч — демонструючи, що ці клітини кодують страх. Аналогічно, створення штучного страху за допомогою позначення гіпокампальних клітин під час дослідження безпечного контексту A, а потім поєднання їх світлового повторного активування з електричним шоком у контексті B спричиняло параліч мишей в контексті A, ніби він був небезпечним — перший штучний імплантат пам’яті. Ці експерименти встановили нейронну основу кодування контекстного страху.

Приклад 2: Дослідження Кору Паркінсона Втрата дофамінергічних нейронів при хворобі Паркінсоні деінхібує ядро ​​стамної (STN) та внутрішню глобульну папіллярну тілецьку (GPi), створюючи патологічні бета-осиляції в базальних гангліях, які погіршують рух. Оптогенетична активація та інактивація конкретних компонентів шляхів (прямий D1-рецепторний шлях стромальних нейронів, непрямий D2-рецепторний шлях нейронів, STN) у моделях гризунів, які розрізали ці циркулярні елементи, щоб визначити, які елементи цих шляхів спричиняють моторні дефіцити Паркінсона та які посередлюють терапевтичний ефект L-DOPA. Ці експерименти вплинули на розвиток ліків і підтвердили фізіологію, що лежить в основі терапії стимуляцією глибоких ділянок мозку. Двостороння активація нейронів STN встановила, що ритмічна активація, яка імітує частоти DBS, а не інактивація, лежить в основі клінічної користі — це підриває початкову модель інактивації.

Приклад 3: Оптогенетичне Відновлення Зору Ретиніт пігментного відкладення руйнує палички та колбочки, зберігаючи внутрішні сітківі клітини на роки. Оптогенетична сенсибілізація виживших сітківкових гангліозних клітин (RGC) до світла використовує швидкодіючі варіанти опсинів (ChrimsonR завдяки червошорету, що зменшує фототоксичність). Після введення AAV-ChrimsonR у вітроподібну порожнину та 5-7 місяців, лікуваний пацієнт з клінічної випробування GS030 відчував світлові спалахи, рух руками і міг ідентифікувати та дістатися до візуальних об'єктів, одягаючи підсилені світлом окуляри — результати, які є безпрецедентними для лікування сліпоти фармакологічним шляхом. На відміну від трансплантації RPE-клітин або фоторецепторів під ретинію, внутрішньосітковий оптогенез використовує існуючу сітківу мікроциркуляцію, включаючи обробку горизонтальними та біполярними клітинами, потенційно забезпечуючи кращу просторову та часову роздільну здатність.

Приклад 4: Повне Оптичне Дослідження Нейронних Циркурій Повне оптичне електрофізіологія поєднує широкосмугове або двофотонне оптогенетичне стимулювання (вираження опсинів у конкретних нейронах) з кальцієвим зображенням (вираження варіантів GCaMP або jGCaMP як оптичні індикатори активності нейронів), щоб одночасно стимулювати та записувати дані від ідентифікованих нейронів. Двофотонне голографічне стимулювання за допомогою модулятора просторової світлової модифікації (SLM) дозволяє ціlevування будь-якого 3D-шару нейронів одночасно з одноклітинним контролем роздільної здатності. Двофотонне кальцієве зображення з використанням широкосмугових або об’ємних (світло-листовий, інвертований конфокальний план) підходів записує дані від сотень до тисяч нейронів одночасно. Разом, оптичні системи дозволяють повністю оптичне дослідження динаміки нейронних циркурій — стимулювання визначених нейронів і читання відповідностей популяції без електродів, що забезпечує дослідження порушення циркурії з роздільною здатністю на рівні окремих клітин у поведінкових тваринах.

Приклад 5: Хеміогенез та DREADDs DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs) — це інженерні GPCR (зазвичай засновані на людських мускаринових ацетилхолінових рецепторах з мутаціями, які пригнічують зв’язування ACh) активуються лише фармакологічно неактивними синтетичними лігандами (клозапін-N-оксид CNO або більш потужним агоністом DREADD DCZ на нижчих дозах). hM3Dq (Gq-зв’язаний DREADD) деполяризує та збільшує нейронну активність, коли застосовується CNO; hM4Di (Gi-зв’язаний) зменшує активність; Gs-зв’язані DREADDs модулюють рівень cAMP. Хеміогенез забезпечує тривалий (години) менш інвазивний модуляцію у вільноповодячих тваринах без імплантації оптоволокна — ідеальний для тестування внеску конкретних ділянок мозку в поведінку протягом часових проміжків, які неможливі з використанням оптики, або для досліджень, що вимагають природного руху без ув’язнення.

Приклад 6: Нейропротезний Розвиток Інтерфейси мозок-комп'ютер (BCI) записують нейронну активність або стимулюють нейрони для відновлення рухових, сенсорних або комунікативних функцій у паралізованих пацієнтів. Нейропроби: маси Утаха (BrainGate), Neuropixels (960 місць запису, 70-мікрометрова відстань — запис від сотень нейронів одночасно), та імплантат N1 Neuralink (1024 електроди, бездротовий переказ). Алгоритми машинного навчання BCI видобувають призначений рух з записаної популяризації активності, що перекладає намір у контроль робота або курсора миші. Оптогенетичний BCI замість електричного стимулювання може забезпечити селективну стимуляцію клітинних типів — для створення штучних соматичних відчуттів, стимулюючи специфічно сірникові ділянки кори мозку. Перші дослідження на людях (BrainGate, штат Мічиган, N-of-1 дослідження) дозволили паралізованим пацієнтам друкувати, спілкуватися та керувати роботами кінцівками.

Приклад 7: Фотофармакологія Фотофармакологія використовує невеликі молекули фотоперемикачів, що містять азобензольні групи, які перемикаються конформацією під дією ультрафіолетового (цис) та синього світла (транс), для надання оптичного контролю над природними рецепторами без експресії опсинів. Фотоперемиканий глутамат (MAG) ковалентно прикріплений до глутаматерних рецепторів з мутаціями, що дозволяє активації рецептора під дією світла без експресії опсинів — корисний, коли ефективність доставки вірусами низька. Фотоперемикачі іонів блокують іонні канали або GPCR при одному ізомерному стані, забезпечуючи світлоконтрольовану фармакологію рецепторів in vivo. Швидкість та селективність клітинних типів обмежені оптогенезом, але фотофармакологія працює в тканинах без генетичної модифікації — потенційно застосовна в клінічних умовах, де доставка AAV неможлива.

Спробуйте онлайн

Все вище працює у вашому браузері – відкрийте симулятор Оптогенетики та Нейроінженерії та змінюйте параметри під час його роботи. Не встановлюється нічого, не завантажується жодного файлу, весь модель живе в одному вікні.

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Optogenetics & Neural Engineering Simulator і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.