Одноклітинне секвенування технології

Вступ до біології окремих клітин

Технології одноклітинного секвенування вимірюють молекулярні профілі окремих клітин, а не усереднюють дані по популяціях, розкриваючи неоднорідність, яка була непомітна в масових аналізах. Навіть генетично ідентичні клітини в одному й тому ж тканистому середовищі займають різноманітні транскрипційні, епігенетичні та протеомні стани – відрізняються за типом клітин, фазою циклу клітинного поділу, метаболічним станом, позицією в мікросередовищі та випадкових коливаннях експресії генів. Масове секвенування РНК усереднює ці відмінності, приховуючи склад тканини, рідкісні популяції клітин і специфічні регуляторні програми. Технології одноклітинного секвенування трансформували наше розуміння організації тканин, розвиткових процесів, імунної неоднорідності та станів пухлинних клітин.

Перший протокол одноклітинного секвенування РНК був опублікований Танг та співавторами у 2009 році, профілюючи окрему бластомеру миші. Сфе́ра цього поля розширилася завдяки мікрофлюїдним краплинкам і нановорамкам, що дозволяють аналізувати тисячі клітин за експериментом при зниженні вартості. Ініціатива «Чомусна клітина» систематично картирує всі людські клітини, використовуючи одноклітинний мульти-омікс у всіх тканинах. Застосування в галузі охорони здоров’я дозволяє ідентифікувати підпопуляції ракових клітин, що сприяють стійкості, стани туморних імунних клітин, які корелюють з відповіддю на імунотерапію, та специфічні нейрональні сигнатури вразливості при нейродегенеративних захворюваннях. Одноклітинне секвенування є, безсумнівно, найбільш значущим технологічним проривом у клітинній біології з моменту появи флуоресцентного мікроскопа.

Одноклітинне секвенування

Методи на основі крапель

Платформи 10x Genomics Chromium та подібні мікрофлюїдні системи на основі крапель утримують окремі клітини разом із баркодованими кульками в водному розчині, що суспендується в олії. Розщеплення клітин у краплині звільняє мРНК, яка гібридизується з полі-dT праймерами на кульці, реплікується за допомогою послідовностей баркоду клітини та UMI (унікальний молекулярний ідентифікатор). Після спільного розширення бібліотеки та секвенування баркоди клітин розділяють прочитання на окремі клітини; UMIs видаляють дублікати копій ПЦР, що дозволяє кількісно оцінити кількість молекул мРНК. Типові експерименти захоплюють 1000-10 000 генів на клітину в 5000-50 000 клітин – достатньо для ідентифікації десятків типів клітин за допомогою кластеризації транскрипційної подібності. Вартість знизилася нижче 1 долара за клітину на великих обсягах, що дозволяє проводити дослідження на рівні популяцій.

Аналіз даних одноклітинного секвенування РНК

Типові робочі процеси аналізу scRNA-seq включають: фільтрацію якості (видалення низькоякісних клітин і порожніх крапель), нормалізацію (коригування варіацій глибини секвенування), зменшення розмірності (PCA, за яким слідує UMAP або t-SNE для візуалізації), кластеризацію (алгоритми на основі графів Leiden або Louvain), та позначення типів клітин (вираження маркерних генів, автоматизований перенос міток з посилань на реферативні атласи). Аналіз траєкторій (псевдочас, швидкість РНК за допомогою співвідношень спленованої та незпленованої мРНК) дозволяє відтворити розвиткові або диференційні траєкторії, розташовуючи клітини вздовж безперервних переходів станів. Виявлення відмінностей у вираженні генів між умовами ідентифікує гени, які регулюються в хворобах. Інference взаємодії клітин-клітин використовує пари експресії рецептор-ліганд для прогнозування міжклітинного сигналізу в контексті тканин.

Одноклітинне мультиомнікс

Доступність хроматину та мультиомнікс

Одноклітинний ATAC-seq (scATAC-seq) аналізує доступність хроматину за допомогою ферменту Tn5 транспозази в окремих клітинах – ідентифікуючи відкриті регуляторні елементи (промотори, посилювачі) клітина за клітиною. Типоспецифічні картини доступності хроматину визначають регуляторний словник: кожна клітинна тип має окремі набори відкритих посилювачів, що зв’язуються з її комбінацією транскрипційних факторів. Одночасне вимірювання доступності хроматину та експресії генів з одних і тих самих клітин (10x Multiome, SHARE-seq) пов’язує активність регуляторного елементу з експресією цільового гена, що дозволяє здійснювати відображення регуляторного елемента в ген – cis-регуляторний елемент до гена. Одноклітинний ATAC-seq пухлин ідентифікує ракові специфічні регуляторні програми та розкриває зміни активності транскрипційних факторів, що сприяють онкогенезу.

Просторова Транскриптоміка

Просторова транскриптоміка відображає експресію генів, зберігаючи при цьому інформацію про просторове положення клітин у тканинах. Visium (10x Genomics) захоплює РНК з міркувань 55 мікрометрових крапок на секціях тканин (~1-10 клітин на точку) за допомогою олігонуклеотидів із просторовою маркуванням. Slide-seq та Stereo-seq досягають майже одноклітинної просторової роздільної здатності. MERFISH та seqFISH використовують послідовні раунди FISH для генів, щоб багатократно вимірювати сотні генів з молекулярною роздільною здатністю, зберігаючи при цьому просторову інформацію. Просторова транскриптоміка розкриває зонування тканин (вираження генів специфічне для зони печінки), просторове угрупування мікросередовища пухлини (розподіл імунних клітин відносно ядра пухлини) та взаємодії ліганди-рецептори між сусідніми клітинами – фізичний контекст близькості невидимий без просторової інформації.

Застосування в медицині та біології

Консорціум «Чомус клітин» створює всебічну посилання карту всіх типів людських клітин за допомогою одноклітинного мульти-оміків у більш ніж 30 органах у здорових донорів, охоплюючи етапи розвитку та демографічну різноманітність. Початкові посилання для легенів, печінки, плаценти, серця, ока, кишківника, мозку та імунної системи були опубліковані, виявляючи раніше невідомі клітинні типи (Іоноцити в дихальній системі, жиро-асоційовані лімфоїдні кластери), рідкісні диференційовані стани та нові маркери. Ці посилання прискорюють інтерпретацію захворювань – виявлення, які клітинні типи експресують гени GWAS, пов’язані з хворобами, для перекладу генетичних відкриттів на механістичні клітинно-біологічні інсайти, ідентифікація клітинних цілей для генної терапії та надання нормальних посилань для порівняння в дослідженнях захворювань.

Приклади та застосування

Приклад 1: Хромосомна неоднорідність ракових клітин scRNA-seq пухлин мозку показав, що окремі пухлини містять клітини, які пересуваються безперервним спектром станів диференціювання, включаючи стовбурові, мезенхімні, астроцитарні та олігодендрогенні прогенітри стани. Цей безперервний ландшафт клітинних станів (клітинна пластичність) переосмислює стійкість до терапії: клітини в різних станах відрізняються за чутливістю до ліків; знищення клітин у одному стані дозволяє іншим реплікувати пухлини. scRNA-seq виявив NPC-подібний (нейропрогенний) стан як найстійкіший до ліків у GBM. Антипухлинна терапія повинна спрямовуватися на всі стани або запобігати переходу станів, що потребує розуміння регуляторів переходів станів — виявлених за допомогою аналізу траєкторій та регулонного висновування з даних scRNA-seq.

Приклад 2: Інфілюруючі пухлину імунні клітини scRNA-seq пухлин, інфікованих імунними клітинами (TIL), показав, що дисфункція T-клітин (виснаження) в пухлинах існує у вигляді розвитку від виснажених стовбурових T-клітин (Tpex, TCF7+) до термінально виснажених (Tim-3+, Tox+). Анти-PD-1 імунотерапія переважно розширює клітини Tpex — чийого збагачення прогнозує відповідь — а не відновлює термінально виснажені клітини. Це розуміння пояснює, чому пухлини з мінімальною кількістю Tpex клітин погано реагують на блокування PD-1. Вираження CXCL13 CD8 T-клітин поблизу пухлинних клітин прогнозує вигоду від імунотерапії. Таким чином, scRNA-seq механічно пояснює біомаркери клінічної відповіді та спрямовує розробку комбінованих стратегій для збільшення проникнення Tpex.

Приклад 3: Атлас людського ембріонального розвитку Одноклітинні атласи людського ембріонального розвитку на стадіях Карнегі з 16 до 70 днів (стадії 1-14) виявили раніше непомітні клітинні популяції та траєкторії диференціювання. Просторова транскриптомка гаструлоїдів і справжніх ембріонів відображала шляхи міграції клітин, градієнти сигналів та специфікації роду. Ці дані показують, як утворюються три зародкові шари, як нервові гребені відшаровуються та мігрують, і як розвиваються органні примордії — надаючи ембріональну

земну правду

для оцінки точності моделей органідів на основі iPSC. Атласи розвитку також виявляють, коли експресуються гени, що викликають захворювання, в уражених прогенітри станах, що дозволяє визначити вікна терапевтичного втручання та механізми вродженої вад.

Приклад 4: Імунний профіль периферичної крові scRNA-seq периферичних мононуклеарних клітин (PBMC) забезпечує всебічний імунний профіль — одночасно відображаючи всі циркулюючі імунні клітини та їх стани. CITE-seq, додаючи вимірювання білкової концентрації на основі антитіл поряд із транскриптомкою, забезпечує мультимодальну імунну фенотипізацію. Популяційні атласи PBMC в тисячах здорових донорів за віком, статтю та етнічним походженням характеризують нормальну імунну варіацію. Застосування захворювань включає характеристики імунопатології COVID-19 (викликаної нейтрофілами та моноцитами еозинофілія, що корелює з тяжкістю), запальні ознаки синовиальної та крові при ревматоїдному артриті, ознаки розгортання SLE, механізми токсичності імунотерапії — всі вони виявлені за допомогою scRNA-seq клітинних станів та пропорцій відносно здорових еталонних атласів.

Приклад 5: Просторова транскриптомка в мозку MERFISH просторова транскриптомка у мишачому мозку відображала 1100 генів з одноклітинною роздільною здатністю в різних областях мозку, ідентифікуючи понад 300 клітинних типів із молекулярно-диференційованими просторовими розподілами. Дані показали точне просторове розташування клітинних типів у різних областях мозку на підрівневому рівні та виявили нові клітинні типи, обмежені конкретними мікродоменами. Просторова транскриптомка людського гіпокампу при хворобі Альцгеймера показала, що зірки II енторгінальної оболонки — клітини, найбільш схильні до ранніх нейрофільних клубочків — мають виражені молекулярні підписи, які можна ідентифікувати за допомогою просторової транскриптомки, що дозволяє досліджувати їх відбіркову вразливість. Просторова транскриптомка мозків з шизофренією та розладами аутистичного спектру виявляє експресію генів на рівні шарів.

Приклад 6: Трасування роду за допомогою одноклітинного баркодування CRISPR-запис і баркодування ДНК дозволяють відстежувати походження клітин з одноклітинною роздільною здатністю — записуючи історію попередніх поділів клітин у геномі. GESTALT/scGESTALT використовує CRISPR-диверсифікацію геному на основі масиву, що генерує унікальний код баркоду, який читається scRNA-seq, записуючи клановий анамнез поряд із транскрипційним ідентифікуванням. TracerSeq мітить прогенітри з успадкованими інтеграціями, які секвенуються разом із транскриптомами. Ці підходи відтворили дерев’яні родинні дерева ембріонального розвитку риби аква, починаючи з однієї клітини, що дозволило ідентифікувати, які прогенітри стани дають вихід певним органам на певних етапах розвитку. Об'єднуючи інформацію про походження із станом транскрипції, можна відновити повні траєкторії розвитку окремих клітин під час утворення органів.

Приклад 7: Аналіз клонального гематопоезу Клональний гематопоез незрозумілих потенціалів (CHIP) зустрічається приблизно в 10% людей старше 65 років із мутаціями DNMT3A, TET2, ASXL1 або JAK2 у клонах HSC. scRNA-seq зразків клонального гематопоезу виявив запальні програми експресії генів у моноцитах та макрофагах TET2-мутованих — що пояснює, чому CHIP пов’язаний із 2-кратною збільшеною ризиком серцево-судинних захворювань через прискорене атеросклерозу. ІЛ-6 та ІЛ-8 запальні шляхи активації у клонах TET2-мутованих можна пригнічувати за допомогою інгібіторів ІЛ-6. Розуміння клонального гематопоезу з одноклітинною точністю направляє клінічні випробування, щоб визначити, чи може антизапальна інтервенція у носіїв CHIP зменшити ризик серцево-судинних захворювань.

Приклад 8: Одноклітинна протеоміка за допомогою мас-спектрометрії SCoPE-MS та подібні методи одноклітинної протеоміки використовують множинну етикеткування в ланцюжку маси (TMT) для окремих клітин, щоб профілювати 1500–3000 білків на клітину. На відміну від вимірювання білків на основі антитіл (обмежене приблизно 100 цілями), протеоміка з мас-спектрометрів одноклітинного рівня є всебічною та не упередженою. Поточний обсяг продуктивності (сотні до тисяч клітин) відстає від scRNA-seq на один або два порядки, що обмежує статистичну потужність рідкісних клітинних популяцій. Технологічні досягнення в підготовці зразків у вигляді ніжок, низькоін'єкційному LC та наступного покоління мас-спектрометрів обіцяють принести одноклітинну протеоміку до масштабу scRNA-seq.

Спробуйте онлайн

Все вище працює у вашому браузері – відкрийте симулятор Одноклітинного секвенування та змінюйте параметри під час роботи. Не встановлюється нічого, не завантажуються файли, весь модель живе в одному вікні.

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Single-Cell Sequencing Simulator і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.