Біологія РНК: Некодуючі РНК та обробка транскріптів

Вступ до біології РНК

Десятиліттями РНК розглядалася переважно як посередник між генетичними кодами та протеїновими продуктами. Відкриття, що більшість людського геному транскрибується, але лише 2% кодує білки, виявило величезний ландшафт не-кодуючих РНК (нРНК) видів з різноманітними регуляторними функціями. нРНК, включаючи мікроРНК, довгі не-кодуючі РНК, кільцеві РНК, РНК, що взаємодіють з PIWI, та малі нуклеолярні РНК, регулюють експресію генів на транскрипційному, посттранскрипційному та рівневому трансляції, відіграючи фундаментальну роль у розвитку, клітинній ідентичності та захворюваннях.

Біологія РНК також охоплює складний процес перетворення пре-мРНК на зрілу мРНК: 5' capping, 3' поліаденілювання, сплайсинг інтронів та редагування РНК. Альтернативний сплайсинг – вибір різних комбінацій екзонів із однієї пре-мРНК – значно розширює різноманітність протеому: приблизно 95% генів людини виробляють кілька сплайсних ізоформ. Посттранскрипційна модифікація РНК нуклеотидів (РНК метилювання, псевдоуридилювання) додає додаткові регуляторні шари – епітранскриптом – з ролями в ефективності трансляції та стабільності РНК.

Малі некодуючі РНК

Місцеві мікроРНК (miRNAs) – це РНК довжиною приблизно 22-30 нуклеотидів, що утворюються з косироподібних попередників за допомогою ферментів Drosha та Dicer. miRNAs інтегруються в RISC (комплекс післямова), який містить білки Argonaute, які зв’язуються з комплементарними послідовностями, переважно в 3'UTR матриці мРНК, викликаючи дестабілізацію мРНК та пригнічення трансляції. Кожна miRNA може впливати на сотні мРНК; людський геном містить понад 2000 miRNAs, які разом впливають на більшість генів, що кодують білки. miR-21 є найбільш часто підвищеною miRNA в пухлинах; miR-122 необхідна для реплікації віру HCV – miravirsen (лактонеоподібна РНК з анти-miR-122) продемонструвала пригнічення віраемії під час клінічних випробувань.

РНК, що взаємодіють з PIWI

РНК, що взаємодіють з PIWI (piRNAs) – це РНК довжиною 26-32 нуклеотиди, які експресуються в стаменах. Вони асоціюються з білками Argonaute кладу PIWI (MILI, MIWI у мишей) та виконують основну функцію – пригнічення транскриптів транспозонів. piRNAs направляють білки PIWI до комплементарних транскриптів транспозонів для розщеплення та також встановлюють спадкове DNA-метилювання, що призводить до пригнічення. Порушення біогенезу piRNA викликає дерегуляцію транспозонів та безпліддя у самців мишей. Шляхи piRNA представляють собою складну систему захисту геному стаменів, яка еволюціонувала для захисту цілісності геному протягом поколінь.

Довгі некодуючі РНК

Довгі некодуючі РНК (дРНК) зазвичай визначаються як РНК з довжиною понад 200 нуклеотидів, які не мають потенціалу для кодування білка. У людському геномі закодовано десятки тисяч дРНК; більшість з них характеризуються низькою експресією, високою специфічністю до тканин та еволюційною консервацією функції, незважаючи на помірну відсутність генетичної схожості. ДРНК регулюють експресію генів за допомогою різних механізмів: XIST покриває неактивні хромосоми X, залучаючи комплекси репресивного Polycomb для пригнічення; HOTAIR залучає PRC2 для пригнічення локусів генів homeobox; NEAT1 утворює ядерні параспекулі; enhancer RNAs транскрибуються з активних ептадер та можуть сприяти обходу зв’язків ептадер-промоторів. Дисрегуляція дРНК є поширеною в раку, з як онкогенними, так і протираковими ролями.

Циркулярні РНК

Циркулярні РНК (цирРНК) утворюються за допомогою неканцеляричного зворотного сплиття, що призводить до утворення ковалентно замкнутих циркулярних молекул РНК, стійких до екзонуклаз. CDR1as (ciRS-7) містить понад 70 сайтів для зв’язування miR-7, потенційно заблокувавши доступ miR-7 до своїх цілей у нейронах. Інші цирРНК регулюють сплайсинг шляхом конкуренції з факторами сплайсингу, переводяться в білки за допомогою внутрішніх РНК-вхідних послідовностей або просто служать стабільними молекулярними губками. Дисрегуляція цирРНК є поширеною в раку, з як онкогенними, так і протираковими ролями.

ЦирРНК утворюються за допомогою неканцеляричного зворотного сплиття, що призводить до утворення ковалентно замкнутих циркулярних молекул РНК, стійких до екзонуклаз. CDR1as (ciRS-7) містить понад 70 сайтів для зв’язування miR-7, потенційно заблокувавши доступ miR-7 до своїх цілей у нейронах. Інші цирРНК регулюють сплайсинг шляхом конкуренції з факторами сплайсингу, переводяться в білки за допомогою внутрішніх РНК-вхідних послідовностей або просто служать стабільними молекулярними губками.

Альтернативне сплайсинг

Альтернативне сплайсинг передбачає, що з людських генів виробляється понад 90 000 різних сплейсових ізоформ — що значно збільшує біорозноманітність із приблизно 20 000 генів. Білки SR сприяють включенню екзонів; hnRNPs часто сприяють пропуску — їх відносні концентрації в клітинному типі визначають результат сплайсингу. Тканево-специфічне сплайсинг (альтернативні ексини, що генеруються нейроксином, створюють тисячі ізоформ для з’єднання нейронних ланок) і розвинково регульоване сплайсинг (регулювання MBNL1/CUGBP екзонів у кардіальних та скелетних м’язах) підкреслюють, як альтернативне сплайсинг сприяє фенотиповій складності. Збої в сплайсингу виникають при раку (мутації на місцях сплайсингу, мутації факторів сплайсингу у мієлоїдних злоякісних новоутвореннях) та неврологічних захворюваннях.

Приклади та застосування

Приклад 1: Терапевтичні засоби на основі інтерферирування РНК Малі фрагменти РНК (21-23 нуклеотидів) з ідеальною комплементарністю до міРНК, що є об’єктом дії, направляють механізм RISC для опосередкованого розщеплення та деградації – інтерферируюча ДНК з високою специфічністю та ефективністю. Викликом доставки siRNA до цільових тканин було вирішено за допомогою ліпідних наночастинок (патісаран, затверджено FDA у 2018 році для успадкованої тріметіліамідоз), кон’югатів з Гала-НАК для гепатоцелюлярного цільового призначення (інкласиран знижує рівень ЛПВ-холестерину шляхом пригнічення експресії мРНК PCSK9) та антитілових кон’югатів. Лікарські засоби на основі siRNA для рідкісних успадкованих захворювань печінки, гіперхолестеролемії та гематологічних станів трансформували можливості лікування.

Приклад 2: Олігонуклеотиди антивідхилення при хворобах Олігонуклеотиди антивідхилення (АО) зв’язуються з цільовою РНК через Watson-Crick базове кодування, спрямовуючи сплайсинг або викликаючи деградацію за допомогою RNase H. Nusinersen (Spinraza) виправляє сплайсинг мРНК SMN2 для виробництва функціонального білка SMN у спастичній мускулатурній атрофії, трансформувавши хворобу, яка в іншому випадку була універсально смертельною, в одну, де багато дітей сидять і ходять. Eteplirsen пропускає екзон 51 пре-мРНК дистрофіну Duchenne у відновленні скороченого, але функціонального білка. Інтотерсен пригнічує експресію мРНК TTR у триретинній амілоїдозі. Ліки на основі АО демонструють, як розуміння сплайсингу та обробки РНК безпосередньо дозволяє розробити лікувальні методи зцілення або зміну захворювання.

Приклад 3: Модифікація м6A РНК N6-метиладенізин (м6А) є найбільш поширеною внутрішньомРНК модифікацією, додаваною комплексом письма METTL3/14, видаленою ферментом очищення ALKBH5/FTO та розпізнаваною білками читання домену YTH, що впливають на стабільність мРНК, переклад, сплайсинг та експорт. М6А позначає збагачення поблизу стоп-кодунів і 3'UTR, що впливає на розпад мРНК; білок читача YTHDF2 сприяє розпаду позначених транскриптів. М6А є критичним для розвитку (викидання Mettl3 призводить до ембріональної смертності), гематопоезу та циркадного ритму. Дисрегуляція машини м6А виникає в багатьох ракових типах – метастазування METTL3 посилює переклад експресії мРНК онкогенів у ШЖК. Епітранскриптом представляє новий рівень регулювання генів з терапевтичними можливостями.

Приклад 4: Мутації факторів сплайсингу при мієлоїдних пухлинах Рекурентні некодильні мутації в основних факторах сплайсингу – SF3B1, SRSF2, U2AF1, ZRSR2 – зустрічаються у 50-60% мієлодиспластичної синдрому (МДС) та 5-10% ШЖК. Мутації SF3B1 викликають аномальний вибір 3' сплайс-сайту, що призводить до альтернативного транскриптування з передчасними стоп-кодунами або зміненою функцією білка від сотень генів. Розуміння того, як ці мутації викликають глобальну дисрегуляцію сплайсингу, що призводить до гематопоетичної дисфункції, спрямовує розробку модуляторів сплайсингу (H3B-8800) як терапевтичних кандидатів. Фактори сплайсингу в основному завжди є гетерозиготними, що свідчить про те, що повне порушення сплайсингу смертельне, обмежуючи терапевтичне націлювання.

Приклад 5: міРНК у серцевих захворюваннях miR-208a кодується в інтроні альфа-МХС і підвищується при кардіальній гіпертрофії; він цілює рецептор гормону щитової функції бета (антигіпертрофний ген). Анти-miR-208a зменшив патологічну кардіальну гіпертрофію в моделях гризунів. miR-122 складає 70% міРНК печінки; його втрата викликає метаболічні розлади ліпідів у печінці. Циркулюючі міРНК (miR-21, miR-499) підвищуються в плазмі після інфаркту міокарда як біомаркери. Лікувальні методи на основі міРНК (міРНК клони та інгібітори) пропонують цільові підходи тканини; виклики включають специфічність доставки, побічні ефекти та велику кількість цілей, які регулює кожна міРНК.

Приклад 6: XIST та інгактивація Х-хромосоми У жіночих ссавців один Х-хромосома епігенетично вимкнений на ранніх стадіях розвитку для досягнення дозованого рівня з чоловіками. ЛнкРНК XIST (~17 кб) транскрибується виключно з неактивної Х-хромосоми в цис, залучаючи комплекси придушення Polycomb (PRC2 депозиту H3K27me3), комплекси HDAC та інші фактори пригнічення, які поширюють гетерохроматичне пригнічення на весь хромосомний рівень. Відновлення XIST у iPSC деривації часто призводить до втрати інгактивації Х – технічної проблеми для моделювання захворювань. Націлювання XIST для специфічного вимкнення аутосомних генів для терапії генами (терапія хромосомами) досліджується для синдрому Дауна та X-лінійних хвороб.

Приклад 7: РНК вакцини Успішні мРНК COVID-19 вакцини підтвердили, що РНК є терапевтичною модалністю. МРНК, що кодує антиген, доставляється в ліпідних наночастинках; клітини переводять мРНК, виробляючи антиген, який стимулює імунну відповідь без інтеграції геному. Модифіковані нуклеозиди (Pseudouridine, N1-метил-pseudouridine) зменшують індукцію імунної відповіді вродженого типу та покращують ефективність перекладу – ключові інновації, що дозволяють ефективним мРНК вакцинам. Платформа дуже гнучка; кандидатські мРНК вакцини проти грипу (мультивалентні, перехресні захисні), RSV, ВІЛ та персональних ракових вакцин на основі неоантигенів (з Moderna та BioNTech) перебувають на стадії клінічних випробувань.

Приклад 8: Рис-перемикачі в бактеріях Рис-перемикачі є структурованими РНК елементами в 5'UTR мРНК бактерій, що зв’язуються безпосередньо з малі молекулами, змінюючи вторинну структуру для регулювання експресії генів без білкових кофакторів – РНК, яка діє як сенсор і регуляторний перемикач. Перемикачі TPP (тиамін фосфат) регулюють гени синтезу тиаміну; перемикачі SAM регулюють гени метаболізму метионіну; перемикачі пуринів регулюють обмін нуклеотидів. Рис-перемикачі надали перших доказів гіпотези про РНК світу – що древні молекули РНК, які виконують як каталітичні, так і регуляторні функції, передували біохімічному генному регулюванню. Рис-перемикачі є перспективними мішенями для антибіотиків, з речовинами, які зв’язуються з бактеріальними рис-перемикачами, що не мають у людини відповідних гомеологів, потрапляють на ранній стадії розробки.

Спробуйте онлайн

Все вище працює у вашому браузері – відкрийте симулятор «Зшивання та обробка РНК» і змінюйте параметри під час його роботи. Не встановлюється нічого, не завантажуються дані, весь модель живе в одному вікні.

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте RNA Splicing & Processing Simulator і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.