Регуляція Алістерічних Ферментів та Симулятор Кооперативності

Сигмоїдальна Кінетика проти Гіперболи Мішельса-Ментена

Класичний фермент за типом Мішельса-Ментена, такий як багато травних ферментів, характеризується гіперболічною залежністю швидкості реакції від концентрації субстрату, описаною рівнянням v = Vmax * S / Km + S. Ця крива різко зростає при низьких концентраціях субстрату і поступово згладжується, коли фермент наближається до максимальної швидкості, без раптових переходів будь-де вздовж кривої. Алістерні ферменти, що мають декілька взаємодіючих підсуб’єктів, замість цього слідують за рівнянням Хілла, яке генерує сигмоїдальну, або S-подібну, криву. При дуже низьких концентраціях субстрату фермент проявляє слабку активність, оскільки зв'язування першої молекули субстрату є вроджено складним, але після того, як ця перша взаємодія відбувається, вона викликає конформаційну зміну, часто описовувану конкордантною (Монод-Вайман-Чанке) або послідовною (Кошланд-Немечті-Фільмер) моделями, що збільшує прихильність сусідніх активних центрів до додаткового субстрату. Це створює різкий, майже перемиковий, підйом в активності на вузькому діапазоні концентрацій перед тим, як крива вирівнюється на Vmax, подібно до гіперболічного ферменту. Різкість цього переходу кількісно визначається коефіцієнтом Хілла, позначеним n, де значення 1 вказує на відсутність кооперативності або просту поведінку за типом Мішельса-Ментена, а значення вище 1 – на все більш сильне позитивне співробітництво.

Алістерні центри, регуляторні молекули та двоконфорний механізм дії ферментів

Термін ‘allosteric’ походить від грецьких коренів, що означають ‘інша форма’, відображаючи основну ідею про те, що регулювання відбувається на сайті, геометрічно віддаленому від каталітичного активного центру. Згідно з широко використовуваною конкордантною моделлю, запропонованою Жак Моно, Джеффри Уайманом та Жан-Піром Шансо в 1965 році, алістерна ферментна молекула існує у рівновазі між двома глобальними конформаціями: напруженим (T) станом з низькою прихильністю субстрату та розслабленим (R) станом з високою прихильністю субстрату. Зв’язування субстрату переважно стабілізує стан R, поступово перетягуючи всю популяцію ферментних молекул до конформації з високою прихильністю, що є структурною основою для позитивної кооперативності. Регуляторні молекули використовують цю саму рівновагу. Позитивний алістерний ефектор (активатор) зв’язується з відмінним регуляторним сайтом і стабілізує стан R навіть без присутності субстрату, зсуваючи сигмоїдну криву вліво та знижуючи ефективну константу прихильності (Km), таким чином, фермент стає активним за нижчих концентрацій субстрату. Негативний алістерний ефектор (інхібітор) робить навпаки, стабілізуючи стан T і зсуваючи криву вправо, вимагаючи значно вищих концентрацій субстрату для досягнення тієї ж швидкості реакції, та в деяких випадках зменшуючи максимальну досяжну швидкість. Оскільки зв’язування ефекторів часто є зворотним і швидко регулюється, алістерне регулювання дає клітинам швидкий, налаштовуваний вимикач для активності ферментів, який працює в часовому діапазоні від мілісекунд до секунд – значно швидше, ніж зміни транскрипції, необхідні для виробництва більшої кількості білків ферменту.

Зворотне гальмування в метаболічних шляхах

Одне з найважливіших біологічних функцій усіхергонічної регуляції – це зворотне гальмування, коли кінцевий продукт багатоетапного метаболічного шляху всеергонічно пригнічує фермент раніше в тому ж самому шляху. Класичним прикладом є шлях біосинтезу амінокислоти ізолейцину у бактеріях, де фермент тетрагідрофолат-редуктаза (ТГФР) каталізує перший контрольований етап; коли ізолейцин накопичується, він зв’язується з всеергонічним місцем на ТГФР і вимикає фермент, запобігаючи клітині неефективному надпродукції амінокислоти, якої вона більше не потребує. Також є добре вивчений приклад у людини – фосфрукта Kinaza-1 (PFK-1), що є найшвидшим ферментом гліколізу, який всеергонічно пригнічується високими концентраціями АТФ та цитрату, сигналізуючи про те, що клітина вже має достатньо енергії, і всеергонічно активується AMP та фруктозо-6-фосфатом, сигналізуючи про дефіцит енергії. Це подвійне регулювання дозволяє гліколітичному потоку реагувати майже миттєво на реальний енергетичний стан клітини без необхідності синтезу нових білків. Аспартат трансамінаяза (ATCase), фермент, що каталізує перший етап синтезу піримідинових нуклеотидів у E. coli, є ще одним типовим прикладом, пригнічується кінцевим продуктом ЦТП та активується АТФ, а його 12-суб’юнктна структура відіграла вирішальну роль у встановленні консенсусної моделі всеергонічної регуляції за допомогою рентгенівських дифракційних досліджень у 1960-х та 1970-х роках. Зворотне гальмування, як описано вище, є поширеним явищем в метаболізмі, надаючи клітинам самокоригуючий термостат для десятків біосинтетичних шляхів одночасно.

Приклад Розрахунку: Кооперативна Оксигенація Гемоглобіну

Хоча гемоглобін є транспортним білком, а не ферментом, він залишається найбільш інформативним прикладом кооперативності завдяки тому, що його поведінку можна безпосередньо вимірювати за допомогою кривої насичення киснем. Гемоглобін складається з чотирьох суб'юнітів, кожен з яких може зв’язувати одну молекулу кисню, і зв’язування кисню з першим суб'юнітом викликає конформаційну зміну, яка збільшує оксигеназний поріг привабливості для решти трьох суб'юнітів, точно відповідаючи стабілізації R-стану, описаній у моделі згуртування. Це створює сигремоїдальну криву дисоціації кисню-гемоглобіну, яку можна знайти в кожному підручнику фізіології: при низькому парціальному тиску кисню, що зустрічається в метаболічно активних тканинах, гемоглобін легко вивільняє кисень, а при високому парціальному тиску кисню, що зустрічається в легенях, він ефективно наповнюється, і різкий центральний відрізок кривої означає, що невеликі зміни парціального тиску кисню призводять до великих змін у доставці кисню. Ця крива сама по собі регулюється всіостеричним шляхом. Протони та вуглекислий газ, обидва вироблені активними тканинами, зв’язуються з усіостеричними ділянками гемоглобіну і зміщують криву вправо, явище, яке називається ефектом Борна, сприяючи вивільненню кисню саме там, де він найбільш потрібен. Молекула 2,3-бісфосфогліцерат (2,3-BPG), що утворюється під час гліколізу еритроцитів, зв’язується з центральним отвором деоксигемоглобіну і таким чином зміщує криву вправо, тому рівень 2,3-BPG підвищується при хронічній гіпоксії, наприклад, на великій висоті, щоб допомогти тканинам отримувати більше кисню від кожної проходячої еритроцити.

Історія відкриття та сучасна структурна біологія

Концепція аллостерії виникла у середині 20-го століття, коли біохіки намагалися пояснити, чому деякі ферменти не слідували простим гіперболічним кінетичним рівнянням, описаним Леонар Кемпбел Міхельс та Мауд Ментен у 1913 році. Ключовим моментом стало 1965 рік, коли Монод, Вайман і Шанжуа опублікували їхню скоординовану (MWC) модель, яка пропонувала, що багатосуб’єктні білки перемикаються кооперативно між лише двома глобальними конформаційними станами, математично елегантний каркас, який успішно передбачав поведінку гемоглобіну та ATCase. Опонентом була послідовна модель, запропонована Даніелем Кошландом, Джорджем Немечті та Девідом Фільмером того ж періоду, яка стверджувала, що суб’юкти змінюють конформацію по черзі у відповідь на зв'язування з субстратом, викликаючи прогресивне збільшення прихильності сусідів – модель, краще підходяща для певних ферментів, які проявляють негативну кооперативність, де зв’язування першого субстратного молекули фактично зменшує прихильність на залишених сайтах. Десятиліття рентгенівської кристалографії, починаючи з знакових структур Максом Пертузом окси- та деоксигемоглобіну в 1960-х роках, забезпечили атомно-розрядні докази того, що конформаційні зміни дійсно поширюються між білковими підрозділами точно так, як передбачали ці моделі. Сьогодні аллостерична регуляція – це не просто біохійне дивовижне явище, а значний простір для досліджень у сфері розробки ліків; фармацевтичні дослідники все більше націлюються на аллостеричні сайти замість активних сайтів, оскільки аллостеричні ліки можуть досягти більшої селективності між близькими за спорідненістю підтипами ферментів і тонко налаштовувати активність, а не просто блокувати її, стратегія, яка вже використовується в ліках для діабету, раку та неврологічних захворювань.

Часті запитання

Спробуйте наживо

Усе, що вище, працює прямо у вашому браузері — відкрийте Allosteric Enzyme Regulation and Cooperativity Simulator і змінюйте параметри під час роботи. Нічого не встановлюється, нічого не завантажується на сервер, уся модель живе в одній вкладці.