⚡ Gel Electrophoresis — Separating Molecules by Size

Pole elektryczne ciągnie naładowane cząsteczki przez porowatą siatkę żelu. Siatka działa jak sito: większe cząsteczki bardziej się plączą i spowalniają niż mniejsze, więc po ustalonym czasie działania cząsteczki o różnych rozmiarach kończą rozłożone na osobne prążki uporządkowane według rozmiaru.

DNA niesie silny, netto ujemny ładunek ze swojego szkieletu fosforanowego, więc jest ciągnięte w stronę dodatniej anody. Białka mają zmienny naturalny ładunek, ale w SDS-PAGE są pokrywane ujemnie naładowanym detergentem SDS, co sprawia, że one też migrują jednolicie w stronę anody.

Mniejsze cząsteczki prześlizgują się przez losową sieć porów żelu z mniejszym oporem, podczas gdy większe muszą wielokrotnie się ściskać lub omijać włókna siatki, co spowalnia ich prędkość netto. Ten zależny od rozmiaru opór jest tym, co zamienia pojedyncze pole w narzędzie do rozdzielania według rozmiaru.

Stężenie żelu ustala średni rozmiar porów. Żel o wyższym procencie ma mniejsze pory, dobrze rozdzielające małe fragmenty, ale działające wolniej, czasem niemal uwięziające duże fragmenty. Żel o niższym procencie ma większe pory, lepszy do rozdzielania dużego DNA, ale o gorszej rozdzielczości między podobnie dużymi małymi fragmentami.

Drabina DNA to mieszanina fragmentów o znanych, standardowych rozmiarach, uruchamiana we własnym pasie obok próbek. Wykreślenie log(rozmiar) w funkcji odległości migracji dla drabiny daje niemal liniową linię kalibracyjną; pomiar, jak daleko przebył nieznany prążek, i odczytanie jego pozycji na tej linii pozwala oszacować jego rozmiar.

Nawet cząsteczki o identycznym rozmiarze dyfundują losowo podczas ruchu, więc prążek, który zaczyna jako ostra linia, stopniowo rozprzestrzenia się w szerszą, słabszą strefę. Zbyt długie uruchamianie żelu wymienia rozdzielczość na rozmycie, dlatego przebiegi zatrzymuje się, gdy najmniejsze fragmenty zbliżą się do dalekiej krawędzi żelu.

Elektroforeza żelowa leży u podstaw profilowania DNA i kryminalistyki, weryfikacji rozmiarów produktów PCR, analizy białek metodą SDS-PAGE oraz początkowego etapu rozdzielania w procedurach Southern, Northern i Western blot, wykorzystywanych w biologii molekularnej i diagnostyce.

Żele agarozowe mają większe, mniej jednolite pory i są zwykle używane do fragmentów DNA od około 100 pz do dziesiątek kilozasad. Żele poliakryloamidowe mają drobniejsze, bardziej regulowalne pory i są używane do wysokorozdzielczego rozdzielania małych fragmentów DNA lub białek, jak w SDS-PAGE.

Stałe pole utrzymuje siłę elektroforetyczną na każdej naładowanej cząsteczce stałą, więc prędkość migracji zależy przewidywalnie od rozmiaru i struktury porów, a nie od zmieniającego się pola. To sprawia, że linia kalibracyjna drabiny jest wiarygodna do szacowania rozmiaru nieznanych próbek.