Як це працює
Ця симуляція моделює вертикальний гель-електрофорез. Заряджені фрагменти ДНК завантажуються в лунки вгорі доріжки гелю (кінець катода). При подачі напруги негативно заряджені фрагменти притягуються донизу до позитивного анода. Під час руху полімерна сітка гелю діє як сито: малі фрагменти легко проходять крізь пори, тоді як великі зазнають більшого опору, тому їхня швидкість міграції спадає зі збільшенням розміру. З часом фрагменти, що починали разом у лунці, розділяються на окремі смуги, впорядковані від найменшого (пройшов найдалі) до найбільшого (найближче до лунки).
Доріжка-маркер, що містить фрагменти відомих стандартних розмірів, проганяється поруч із невідомими зразками. Оскільки відстань міграції приблизно слідує степеневому закону відносно розміру фрагмента в режимі ситового просіювання Огстона, побудова графіка log(відстань) проти log(розмір) для маркера дає майже пряму калібрувальну лінію. Знаходження відстані міграції невідомої смуги на цій лінії та зчитування дозволяє оцінити її розмір — саме так реальні гелі аналізують у лабораторії.
Показник просіювання: n = 0.35 + 0.25·C (крутіший для вищого % гелю C)
Калібрування: log(d) ≈ log(k·V/C) − n·log(розмір)
Розширення смуги (дифузія): σ(t) зростає приблизно як √t
Часті запитання
Як гель-електрофорез розділяє молекули за розміром?
Електричне поле тягне заряджені молекули крізь пористу гелеву сітку. Сітка діє як сито: великі молекули заплутуються і сповільнюються сильніше, ніж малі, тому після фіксованого часу молекули різних розмірів опиняються розділеними на окремі смуги, впорядковані за розміром.
Чому фрагменти ДНК і більшість білків мігрують до позитивного електрода?
ДНК несе сильний сумарний негативний заряд через фосфатний остов, тому притягується до позитивного анода. Білки мають різний власний заряд, але у SDS-PAGE вони вкриваються негативно зарядженим детергентом SDS, який змушує їх також мігрувати рівномірно до анода.
Чому менші фрагменти мігрують швидше за більші?
Менші молекули проходять крізь випадкову сітку пор гелю з меншими перешкодами, тоді як більші молекули змушені багаторазово протискатися чи обходити волокна сітки, що сповільнює їхню сумарну швидкість. Ця залежність опору від розміру перетворює просте поле на інструмент розділення за розміром.
Що контролює відсоток агарози чи поліакриламіду в гелі?
Концентрація гелю визначає середній розмір пор. Гель з вищим відсотком має менші пори, добре розділяє малі фрагменти, але йде повільно, іноді майже знерухомлюючи великі фрагменти. Гель з нижчим відсотком має більші пори, краще для великої ДНК, але гірше розрізняє близькі за розміром малі фрагменти.
Для чого використовується ДНК-маркер?
ДНК-маркер — суміш фрагментів відомих, стандартних розмірів, що проганяється у власній доріжці поруч зі зразками. Побудова log(розмір) проти відстані міграції для маркера дає майже лінійну калібрувальну лінію; вимірявши відстань невідомої смуги і зчитавши її позицію на лінії, можна оцінити її розмір.
Чому смуги розширюються або розмиваються при довгому проведенні?
Навіть молекули однакового розміру дифундують випадково під час руху, тому смуга, що починається як чітка лінія, поступово розтягується у ширшу, тьмянішу зону. Занадто довге проведення обмінює роздільну здатність на розмиття, тому проведення зупиняють, коли найменші фрагменти наближаються до краю гелю.
Які реальні застосування гель-електрофорезу?
Гель-електрофорез лежить в основі ДНК-дактилоскопії та криміналістичного профілювання, перевірки розмірів продуктів ПЛР, аналізу білків методом SDS-PAGE, а також початкового етапу розділення в Саузерн-, Нозерн- і Вестерн-блотингу в молекулярній біології та діагностиці.
У чому різниця між агарозними та поліакриламідними гелями?
Агарозні гелі мають більші, менш однорідні пори і використовуються для фрагментів ДНК від ~100 п.н. до десятків тисяч пар основ. Поліакриламідні гелі мають дрібніші, точніше регульовані пори і використовуються для високороздільного розділення малих фрагментів ДНК або білків, як у SDS-PAGE.
Чому під час проведення застосовують постійну напругу?
Стала напруженість поля тримає електрофоретичну силу на кожній зарядженій молекулі сталою, тому швидкість міграції передбачувано залежить від розміру та структури пор, а не від змінного поля. Це робить калібрувальну лінію маркера надійною для визначення розміру невідомих зразків.