🔬 Sekwencjonowanie DNA

Smith-Waterman to algorytm programowania dynamicznego służący do lokalnego dopasowania sekwencji, wprowadzony przez Temple'a Smitha i Michaela Watermana w 1981 roku. Wypełnia on macierz punktacji, w której każda komórka score(i,j) = max(score(i-1,j-1) + substytucja(i,j), score(i-1,j) - kara_za_przerwę, score(i,j-1) - kara_za_przerwę, 0). Dolne ograniczenie zerowe to kluczowa różnica względem dopasowania globalnego: pozwala rozpocząć dopasowanie w dowolnym miejscu i zakończyć je w dowolnej komórce o wysokiej punktacji, dzięki czemu metoda ta doskonale nadaje się do dopasowywania krótkich odczytów do dłuższej referencji, nawet gdy odczyt jest zaszumiony lub tylko częściowo się pokrywa.

SNP to pozycja w genomie, w której pojedyncza zasada różni się między osobnikami lub między sekwencjonowaną próbką a sekwencją referencyjną. W danych sekwencjonowania SNP objawia się jako spójna niezgodność w wielu niezależnych odczytach na tej samej pozycji. Programy wykrywające warianty odróżniają prawdziwe SNP od błędów sekwencjonowania, wymagając, aby alternatywna zasada występowała w minimalnym odsetku odczytów (zazwyczaj 20–30%) i przy wystarczającym pokryciu (często co najmniej 8x). Błędy losowe są rozproszone po odczytach i pozycjach, natomiast prawdziwy SNP powtarza się w tym samym miejscu w każdym odczycie, który je obejmuje.

N50 to długość najkrótszego kontigu w zbiorze najdłuższych kontigów, które razem pokrywają co najmniej 50% całkowitej długości złożenia. Jest to mediana ważona długością, a nie zwykła średnia: garstka długich kontigów może znacząco podnieść N50, nawet jeśli istnieje wiele krótkich kontigów. W tej symulacji wyższe pokrycie i niższa częstość błędów dają mniej, ale dłuższe kontigi, a tym samym wyższe N50. Wskaźnik ten jest standardowym miernikiem służącym do porównywania ciągłości złożenia genomu; złożenie genomu ludzkiego z N50 powyżej 10 Mb uznaje się za osiągające skalę chromosomową.

Frederick Sanger i Walter Gilbert niezależnie opracowali pierwsze praktyczne metody sekwencjonowania w 1977 roku, za co w 1980 roku wspólnie otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Metoda terminacji łańcucha opracowana przez Sangera stała się podstawowym narzędziem Projektu Poznania Ludzkiego Genomu, ukończonego w 2003 roku kosztem około trzech miliardów dolarów. Wprowadzenie platform Illumina do sekwencjonowania krótkich odczytów w połowie lat 2000. obniżyło koszt sekwencjonowania jednego genomu do poniżej tysiąca dolarów do 2014 roku. Oxford Nanopore i Pacific Biosciences wprowadziły następnie sekwencjonowanie długich odczytów, umożliwiające niemal kompletne złożenie złożonych genomów, w tym pierwszej w pełni ciągłej sekwencji referencyjnej człowieka opublikowanej w 2022 roku.

Genomika kliniczna wykorzystuje sekwencjonowanie do diagnozowania rzadkich chorób genetycznych, ukierunkowywania leczenia nowotworów poprzez profilowanie mutacji guza oraz badań przesiewowych noworodków w kierunku setek chorób dziedzicznych. Genomika chorób zakaźnych umożliwiła szybkie śledzenie wariantów SARS-CoV-2 podczas pandemii COVID-19. Rolnictwo wykorzystuje sekwencjonowanie do hodowli odmian roślin odpornych na choroby i o wysokiej wydajności. Kryminalistyka korzysta z profilowania krótkich powtórzeń tandemowych (STR) do identyfikacji osób, a środowiskowe DNA (eDNA) pozwala ekologom badać bioróżnorodność na podstawie próbek wody lub gleby bez konieczności odławiania organizmów.

Niekoniecznie. Pokrycie podlega prawu malejących przyrostów: wzrost z 5x do 30x drastycznie poprawia kompletność złożenia i dokładność wykrywania SNP, ale wzrost ze 100x do 500x daje niewiele dla standardowego genomu diploidalnego. Bardzo wysokie pokrycie może nawet wprowadzać szum, ponieważ artefakty sekwencjonowania — takie jak duplikaty optyczne na platformach Illumina — kumulują się i muszą zostać usunięte. W większości badań wariantów germinalnych standardem jest 30x; w przypadku wykrywania mutacji somatycznych w nowotworach, gdzie tylko część komórek niesie mutację, może być wymagane ukierunkowane pokrycie rzędu 100–1000x.

Dopasowanie mapuje odczyty do istniejącej sekwencji referencyjnej; składanie odtwarza sekwencję od podstaw, bez referencji, wykorzystując wyłącznie nakładanie się odczytów. Podejście overlap-layout-consensus (OLC) zastosowane w tej symulacji wyszukuje pary odczytów mające wspólne nakładanie się sufiksu i prefiksu, buduje graf nakładań, wyznacza w nim ścieżkę (layout) i wyprowadza konsensusową zasadę dla każdej pozycji. Składanie na grafach de Bruijna, stosowane przez narzędzia takie jak SPAdes czy Velvet, to alternatywne podejście dzielące odczyty na krótkie k-mery, lepiej dostosowane do krótkich odczytów Illumina. Programy do składania długich odczytów, takie jak Flye i Hifiasm, mogą tworzyć niemal kompletne chromosomy w jednym cyklu.

Wysoce powtarzalne regiony — centromery, telomery i duplikacje segmentowe — pozostają trudne do złożenia, ponieważ odczyty krótsze niż jednostka powtórzenia nie mogą jednoznacznie ich objąć; rozwiązują to jedynie ultra-długie odczyty (100 kpz+) z platform Oxford Nanopore. Fazowanie haplotypów, czyli ustalanie, które warianty występują na tej samej kopii chromosomu, wciąż wymaga dużej mocy obliczeniowej w przypadku heterozygotycznych genomów diploidalnych lub poliploidalnych. Sekwencjonowanie epigenomiczne, które jednocześnie odczytuje sekwencję zasad i metylację DNA z tej samej cząsteczki, to rozwijająca się możliwość. Transkryptomika przestrzenna, mapująca ekspresję genów na fizyczne lokalizacje w skrawkach tkanki, oraz sekwencjonowanie pojedynczych komórek, obejmujące sekwencjonowanie indywidualnych komórek zamiast całych populacji, szybko poszerzają zakres tego, co sekwencjonowanie może ujawnić.