Spectrofotometria masowa: wagowanie molekuł na podstawie czasu lotu

Co Wariometr Masy Właściwie Miara

Nawet nazwa sugeruje inaczej: wariometr masy nigdy nie miarę mas bezpośrednio. To, co on miara, to stosunek masy do ładunku (m/z), gdzie m to masa iona, a z to liczba podstawowych ładunków, które on nosi. Powodem jest jedynie praktyczny: każdy sposób manipulacji i wykrywania molekuły wewnątrz urządzenia – czyli przyspieszanie jej polowym polem elektrycznym lub odchylanie ścieżki magnetycznym polem – reaguje na siłę działającą na ładunek, a ta siła zależy zarówno od masy, jak i ładunku, nie tylko od masy. Molekuła straciła dwie elektrony zachowuje się znacznie inaczej niż identyczna molekuła, która straciła tylko jedną, nawet jeśli ich masy są prawie takie same, ponieważ ion o podwójnym ładunku czuje siłę przyspieszającą dwa razy większą. To dlatego każdy szczyt w spektrum masy etykietowany jest wartością m/z zamiast masą, a chemicy muszą wiedzieć lub wnioskować stan ładunku (z) przed tym, jak przekonwertują pomiar m/z na rzeczywistą masę molekuły. Dla większości małych organicznych molekuł ionizowanych do jednego ładunku, z równa się 1 i wartość m/z jest bardzo bliska masie molekularnej w jednostkach masowych atomowych, ale dla dużych biomolekuł, takich jak proteiny, które mogą nabrać wielu ładunków naraz, ta różnica staje się kluczowa do prawidłowego interpretowania danych.

Konwersja neutralnej cząsteczki na projektil ładunkowy

Zanim cząsteczka może zostać przyspieszona lub pomierczona, próba musi być przekonwertowana na jony zanieczynione w fazie gazowej, ponieważ pola elektryczne nie mają wpływu na neutralną cząsteczkę. Dwa techniki ionizacji dominują w dzisiejszej masztronii. Ionizacja przez sprężysty spary (ESI) przepuszcza zbiornik ciekłowy przez niciasto, bardzo ładunkowe szczelinkę, tworząc strumień drobnych jonowych kropli; podczas evaporaacji solwentu ładunek koncentruje się aż do momentu krople ponownie rozpadną się, wreszcie zostawiając czyste, łagodnie ładunkowane jonowe cząsteczki molekularne, często z wielokrotnym ładunkiem dla dużych cząsteczek. Ionizacja przez laserowe odbicie na powierzchni (MALDI) z kolei mieszany jest próbek ze skomplikowaną substancją zasobną do odbicia światła, kryształizowany na tablicy metali i niszczy krótkim impulsem laserowym; zasób absorbuje energię laserową, eksplozjwnie wyparowywa się, a próbki cząsteczki przenoszone są już ładunkowane do fazie gazowej, zwykle jednokrotnie. Oba metody są cenione jako łagodne techniki ionizacji, ponieważ dodają lub usuwają ładunek bez zniszczenia ciepławej cząsteczki, co jest istotne dla rozpoznawania dużych, delikatnych biomolekułów, takich jak całe proteiny, które by się rozpadły pod cięższych technikach ionizacji.

Od napięcia i odległości do czytnika zegara

Po ionizacji, molekuła wchodzi w centrum analizatora typu czasu lotu (TOF): obszar przyspieszania, nastepujący przez długi, wolny odcinek lotu pod niskim ciśnieniem. Ion o ładunku q jest przyspieszany przez stałe napięcie V, a pracę wykonaną na nim, qV, całą konwertuje się w energię kinetyczną, więc qV = jedna druga razy masa m razy kwadrat prędkości, czyli qV = (1/2) m v². Rozwiązując dla prędkości otrzymujemy v = pierwiastek z (2qV / m). Każdy ion przyspieszony przez to samo napięcie V wychodzi z sektora przyspieszającego z prędkością zależną tylko od własnej proporcji m/q: lżejsze i bardziej załadowane ioni są rzucane szybciej, cięższe lub mniej załadowane ioni wychodzą wolniej. Ion potem koło na tej stałe prędkości dalej przez stalowy odcinek lotu długości L, bez działania żadnej dodatkowej siły, więc czas, który upłynie zanim dotrze do detektora, jest prosto proporcjonalny do 1/v. Podstawiając wyrażenie dla v dostajemy centralne równanie czasu lotu: t = L pierwiastek z (m / (2qV)). Podnosząc obie strony do kwadratu i przestawiając pokazuje, że m/q jest proporcjonalne do kwadratu czasu, konkretnie m/q = (2V / L²) razy t², co oznacza, że instrument może zamienić pojedyncze, dokładnie pomiarowe czasy przybycia bezpośrednio na proporcję masy do ładunku korzystając tylko z znanej wartości napięcia V i znanej długości stalowego odcinka lotu L. Ponieważ cięższe ioni tej samej ładunkowości zajmują miernie dłuższy czas na przebycie odcinka, sortowanie czasów przybycia jest równoznaczne z sortowaniem molekuł według masy.

Czytanie spektrogramu masowego: masa i struktura razem

Detektor na końcu przestrzeni letnicy zapisuje, ile jonów dotyka go w każdym czasie przybycia, które oprogramowanie instrumentu konwertuje w spektrogram masowy: wykres ilości jonych cząsteczek na osi pionowej przeciwko m/z na osi poziomej. Najwyższe i najprostsze spektrogramy pokazują jeden dominujący zespół odpowiadający jonowi molekularnemu, a jego m/z, raz znane jest stan ładunku, daje masę molu bezpośrednio, często wystarczająco dokładnie, aby wyróżnić wzory formuł chemicznych cząsteczek, które się od siebie różnią tylko o ułamek jednej jednostki masowej atomowej. Jednak molekuly często rozpadają się podczas lub po ionizacji, zwłaszcza gdy dodatkowa energia jest zamiernie dodawana techniką nazywaną dwoistym spektrometrycznym masowym, a spary mniejszych jonów fragmentowych tworzą własne zespół na własnej m/z. Ponieważ molekula tendencjersko rozpadnie się pod wpływem słabszych wiązań chemicznych, wzór masowy fragmentów działa jak zestaw puzzle: różnice w masie między sasiednimi zespolami zespółów fragmentowych ukazują, które cząsteczki, takie jak określony reszt amino lub grupa metyle, były łączone w oryginalnej strukturze. Czytanie spektrogramu masowego jest więc dwa poziomy operacji: najpierw ustalenie ogólnej masy molu z zespółu jonu molekularnego, a następnie odtworzenie połączonych strukturalnie ze sobą zespółów z fragmentowych zespółów pod nim.

Z laboratorium do świata rzeczywistego

Spectrofotometria masowa, a w ogólności mass spectrometry, stała się niezwykle ważna w dziedzinie nauk dokładnie dlatego, że pozwala na wyodrębnianie molekuł z niewielkich próbek ze znacznej precyzji. W proteomice badacze przekształcają białka w krótkie peptydy, pomiar ich mas i wzorców fragmentacji, a następnie porównują te wyniki z bazami danych pochodzenia genomowego, aby wykryć, które białka były obecne we wzorcech próbek komórkowych lub tissu. W badaniach antydopingowych w sportzie mass spectrometry pomaga wykrywać śladowe ilości zakazanych substancji lub ich metabolitów w próbkach moczowi i krwi atletów, nawet na poziomie niewyraźnych sygnałów tła. W forenscyce identyfikuje nieznane puderze, zaspy i narkotyki wydobycia ze scenerii przestępstwa porównując ich wzory fragmentacji do bibliotek referencyjnych, co może służyć jako dowód w sądzie. A w analizie proporcji izotopów wysokiej precyzji mass spectrometry oddziela atomy różniące się jedynie o jeden lub dwa neutrony, takie jak carbon-12 i carbon-13, aby datować próby archeologiczne, śledzić geograficzne pochodzenie żywności i win, czy rekonstruować starożytną historię klimatyczną zapisaną w jaszczurkach lodowych i warstwach glebowych.

Często zadawane pytania

Wypróbuj na żywo

Wszystko powyżej działa bezpośrednio w Twojej przeglądarce — otwórz Mass Spectrometry: Weighing Molecules by Their Flight Time i zmieniaj parametry podczas działania. Nic nie jest instalowane ani przesyłane na serwer, cały model działa w jednej karcie.