Rezonans plazmonowy powierzchniowy: obserwacja wiązania molekuł w czasie rzeczywistym

Fizyka plazmonów powierzchniowych

Płaszmon to kwant kolencyjnej oscylacji gęstości ładunku, który istnieje na granicy między przewodnikiem, zazwyczaj metalem, a dielektrykiem. W pokładkach złota lub srebra wolne elektrony przewodzące zachowują się prawie jak płyn, a gdy światło o odpowiedniej częstotliwości uderza na metal, może je napędzić do koherentnej, welle-formowanej ruchu, który przykleja się do granicy. Ta wola nazywana jest płaszmonem polaritonem powierzchniowym, ponieważ jest to mieszana ekcitaacja połączona oscylacją elektronów z polem elektromagnetycznym światła samego. Nie jak zwykłe welle światła, ta wola płaszmonowa jest evanescentna, co oznacza, że jej intensywność maleje eksponencjalnie, gdy się odchylamy od powierzchni metala w dowolnym kierunku, zamiast propagować się wolno po przestrzeni. Pole evanescentne rozszerza się tylko kilka setek nanometrów do powietrza dielektrycznego nad metal, co jest dokładnie tym, dlaczego rezonans płaszmonowy (PRL) jest tak niewątpliwie czuły na to, co dzieje się bardzo blisko powierzchni, a prawie nie widzi niczego dalej. Aby płaszmon mógł być wzbudzony przez światło, musi zostać spełniony określony warunek dopasowania pędu, ponieważ płaszmony poruszające się po płaskiej powierzchni metala naturalnie noszą więcej pędu niż fale cząsteczki o tej samej energii przechodzące przez dielektryk. Sławnie światło uderzające na pokładkę złota z powietrza lub roztworu nie może bezpośrednio wzbudzić płaszmonu ze względu na to, że pędy są niezgodne. Badacze okrążają to używając technik sprzężenia, najczęściej przekątnej szkła, która efektywnie spowalnia światło i zwiększa jego pęd po granicy do tego, co jest równe pędowi płaszmonu powierzchniowego. Po spełnieniu warunku dopasowania, energia jest skutecznie przenoszona z przychodzącego światła do woli płaszmonowej, a to jest zauważane jako ostre zmniejszenie intensywności odbitego światła od pokładki metali, obserwowane pod bardzo konkretnym kątem lub długowieczności.

Konfiguracja Kretschman

Najczęściej używana praktyczna konfiguracja do podrywania plazmonów powierzchniowych w laboratorium nosi nazwę konfiguracji Kretschmana, ona została opisana przez fizyka, który ją zdefiniował na początku lat sześćdziesiątych. W tej ustawieniu pokładem metalicznym, zazwyczaj o grubości około pięćdziesiąt nanometrów, jest delikatnie zdeponowana warstwa złota bezpośrednio na płaskiej powierzchni przystroju z pryzmatem szklanym o wysokiej współczynniku załamania. Przepływająca przez pryzmat strumienia światła, zwykle z laseru, jest skierowana tak, że uderza na warstwę złota pod kątem większym niż krytyczny dla całkowitego załamania. Ponieważ światło przepływa przez gęsty pryzmat szklany przed dotarciem do metali, otrzymuje dokładnie tyle dodatkowej pędzistwo, aby dopasować się do pędzistwa fal plazmonowych na drugiej stronie warstwy złota, strony wyjściowej do powietrza lub wodnej próbki. Podczas przegubu kąta uderzenia przez szeroki zakres, na jednym konkretnym kącie, nazywanym kątem rezonansowym, przychodzące światło łączy się prawie idealnie z falą plazmonową powierzchniową, co spowoduje drastyczne zmniejszenie intencji światła odbitego z powrotem przez pryzmat, tworząc charakterystyczną dół w wykresie odsetka odbicia w zależności od kąta. Zamiast przegubu kąta, niektóre instrumenty utrzymują kąt stały i zamiast tego przegubiają długość fali światła, aby znaleźć warunek rezonansowy; obie te podejścia badają tę samą podstawową fizykę. Precyzyjne położenie tego dolka rezonansowego jest bezpośrednim i czułym odczytem współczynnika załamania medium, które leży na drugiej stronie warstwy złota, od strony oddalonej od pryzmatu, dokładnie tam, gdzie umieszczana jest powierzchnia biosensoryczna z załączonymi cząsteczkami receptora. Ta geometria wydajnie rozdziela ścieżkę podrywania optycznego, poprzez pryzmat szklany, od powierzchni dostrzegającej płyn, pozwalając na ciągły i rzeczywistoprawidłowe pomiary podczas wymiany roztworów nad warstwą złota.

Z optiki do biosenzyrographii

Konwersja tego fotonowego zjawiska na praktyczny biosensoryk wymaga sposobu wybrania celowych molekuł w miejscu, gdzie plazmon jest czuły na zmiany współczynnika przelatywalności. Naukowcy to osiągają poprzez chemiczne funkcjonalizowanie folii zlota warstwą organiczną, często monolaryną samoszkodzaną, do której cząsteczki receptora, takie jak antybody, proteinowe receptory, łańcuchy DNA lub aptamerzy są wiążąco przypinane. Następnie próba zawierająca potencjalnego partnera wiązania, nazywanego analizatorem, płynie ciągle przez powierzchnię funkcjonalizowaną w małym kanału płynicznym. Gdy molekuły analizatora w rozpuszczonym stanie rozpoznają i wiążą się z przypinanymi receptorami, masa akumuluje się na powierzchni, a ponieważ biomolekyly są obwieszczane o wyższy współczynnik przelatywalności niż bufor wodny otaczający, to lokalne zwiększenie masy podnosi współczynnik przelatywalności w obszarze czujnym. Zmiana współczynnika przelatywalności spowodowana jest przesunięciem kąta rezonansowego do wartości lekko większej, a instrument śledzi to przesunięcie kątowe ciągle, tworząc ślad w czasie rzeczywistym nazywany sensorgramem, który rysuje sygnał rezonansowy przeciwko czasowi. Przy każdym zwiększeniu wiązania molekuł analizatora podczas fazy iniekcji sygnał wzrasta; gdy rozpuszczanie zawierające molekuły analizatora jest zamienione na puro bufor, poprzednio przypinane molekuły zaczynają się rozwijać i sygnał opada ponownie. Ponieważ podstawą detekcji jest proste zmiana współczynnika przelatywalności spowodowana akumulacją masy, nie jest potrzebny etykietowany fluorescencyjny zasobnik, etykietka radioaktywna ani antybody drugiego stopnia, co wyróżnia SPR wśród wielu powszechnych badan biochemicznych. To bezetykietytość i detekcja w czasie rzeczywistym jest to, co sprawia, że SPR jest wyjątkowo mocny do studiowania podstawowej fizykochemii interakcji molekularnych, jak się naprawdę zdarzają, a nie tylko pomiar końcowego stanu po zakończeniu reakcji.

Wyciąganie kinetyki wiązania

Zwrotne siła analizy SPR pochodzi od kształtu sensorogramu, który koduje nie tylko fakt wiązania się dwóch molekuł, ale także szybkość ich związkowania i rozłączania. W fazie wstrzymania, gdy roztwór analitu pierwszy raz przepływa przez powierzchnię czujnika, sygnał wzrasta pod kątem zależnym od staletki związkowania, często oznaczonej jako k subskrypt on, która opisuje szybkość, z jaką wolne receptory i molekuły analitu znajduje się w siebie i tworzy kompleks. Zobserwowana prędkość wzrostu sygnału zależy zarówno od tej staletki związkowania, jak i koncentracji analitu w roztworze, dlatego badacze zwykle powtarzają eksperyment przy wielu różnych koncentracjach analitu, aby matematycznie rozdzielić te wpływy. Po zakończeniu wstrzymania i przepływaniu tylko buforu przez powierzchnię, wiązane kompleksy zaczynają się rozłączać, a sygnał maleje pod kątem staletki rozłączania, czyli k subskrypt off, który odzwierciedla stabilność wiązanego kompleksu po jego tworzeniu, niezależnie od koncentracji. Proporcja tych dwóch staletek daje stałą równowagową rozłączania, zwykle skróconą do K subskrypt D, jednoznaczne liczebne wyrażenie sumarycznej wiążącej siły między dwiema molekułami; mniejsza wartość oznacza mocniejsze, bardziej stabilne wiązanie. Ponieważ SPR mierzy obie te staletki bezpośrednio z kształtu krzywej, a nie tylko wnioskując o wiążącą siłę na podstawie punktu równowagi, dostarcza znacznie bogatszych informacji mechanizmicznych niż proste testy wiązania. Ta detalia kinetyczna ma ogromne znaczenie w dziedzinach takich jak odkrywanie leków, gdzie użyteczność kandydatów do leków często zależy równie mocno od czasu, przez który pozostają one wiązane z docelowym celem, regulowanej przez staletkę rozłączania, co na ogół. Badacze farmaceutyczni regularnie używają instrumentów SPR do rangowania kandydatów do leków według ich profilów kinetycznych wiązania przeciwko proteinie terapeutycznemu docelowi, priorytetizując kompoundy z wolnym rozłączaniem dla dalszej rozwijania.

Ważne rozważania i ograniczenia

Nawet mimo swojej mocy, detekcja biosensoryczna sprzążeniem z wykorzystaniem rezonansu plazmonowego powierzchniowego (SPR) ma praktyczne ograniczenia, które badacze muszą dokładnie zarządzać, aby uzyskać wiarygodne dane. Ponieważ technika jest czujna dla jakichkolwiek zmian w indeksie przewodności blisko powierzchni, a nie tylko dla konkretnych zdarzeń połączenia, wszelkie niedokładne interakcje, oscylacje temperatury oraz nawet małe różnice składu bufora między próbą i referencyjną rozwiązaniem mogą wprowadzać artefakty do grafiku czujnika. Dlatego w praktyce prawie zawsze zawierają się surfaże referencyjne, przygotowane bez specyficznego receptora lub blokowane, aby zapobiec połączeniom niepożądanej substancji, co pozwala odejmować niepożądane sygnały z kanału eksperymentalnego. Przemieszczenia w indeksie przewodności spowodowane prostej zmianą bufora na inny, mogą również prowadzić do szybkich skoków sygnału na początku i końcu wprowadzenia, które muszą być rozróżnione od prawdziwych sygnałów połączeń, proces zwany referencjonowaniem lub odejmowaniem pustego sygnału. Efekty transportu mas podnoszą kolejny problem: jeśli cząsteczki analityczne wiążą się z powierzchnią szybciej, niż nowe cząsteczki analityczne mogą rozprzestrzenić się z rozwiązania brykciowego, aby ich zastąpić, przechwycone stawianie się reprezentuje ograniczenia difuzji, a nie rzeczywiste kinetyki wiązania molekularnego; instrumenty muszą być dostosowane odpowiednio do szybkości przepływu i koncentracji cząsteczek analitycznych. Technika działa najlepiej dla interakcji wiążących dużą masę, ponieważ bardzo małe cząsteczki wiążące się z powierzchnią tworzą tylko małe przemieszczenie indeksu przewodności, które może być trudne do rozróżnienia od szumu tła; specjalistyczne projektowanie instrumentów i dokładna chemia powierzchniowa pomagają rozbudować czułość w kierunku mniejszych analityków. Na koniec gęstość i orientacja zabezpieczonych cząsteczek receptora na powierzchni złota silnie wpływają na dostępne połączenia oraz widoczne kinetyki, co sprawia, że protokoły przygotowania powierzchni są kluczowe, często niepostrzegane elementem generowania wiarygodnych danych SPR.

Często zadawane pytania

Wypróbuj na żywo

Wszystko powyżej działa bezpośrednio w Twojej przeglądarce — otwórz Surface Plasmon Resonance: Watching Molecules Bind in Real Time i zmieniaj parametry podczas działania. Nic nie jest instalowane ani przesyłane na serwer, cały model działa w jednej karcie.