Seria Hofmeitza: Dlaczego Soluty Wpływają na Proteinę

Jak Hofmeister Budował Serię

Franz Hofmeister badał zachowanie rozpuszczalne i przypadanie jajowych białek zwojówkowych, gdy zauważył coś niezwykłego: nie tylko koncentracja, ale również tożsamość solutki determinowała, czy białka pozostają rozpuszczone lub przypadają i opadają z roztworu. Zamiast traktować to jako szum, systematycznie zmienił aniony i kationy w setkach solutek i pomiarowano, ile było potrzebne każdego z nich, aby przypaść ustaloną ilość białka. Wynikająca kolejność anionów, nadal cytowana dzisiaj, brzmi około: citrat, sulfat, fosfat większy niż acetat, większy niż chlort, większy niż nitrat, bromyt, większy niż iodot, większy niż thiocyanat. Aniony z lewej strony wymagają bardzo małej ilości solutki do przypadnięcia białek i są nazywane 'salting-out' lub 'kosmotropami' (stosującymi się do budowy struktury). Aniony z prawej strony wymagają znacznie wyższych koncentracji, czyli w rzeczywistości zwiększają solubilitet białek, i są nazywane 'salting-in' lub 'chaotropami' (rozpuszczającymi się w strukturze). Istnieje również równoważna, ogólnie słabsza seria kationów, często zapisywana jako amonat, potas, sód większy niż lipton, magnes, kal, guanidyn. To, co sprawiło, że odkrycie było wyjątkowe, to jego powtarzalność. Taka sama względna kolejność pojawiała się raz po raz, niezależnie od tego, czy Hofmeister przypadał jajowy albumin, testował rozszerzanie jelatyny, czy późniejsi badacze badały całkowicie różne białka, koloidy i nawet napotkaną powierzchnię wody. Ta zgodność na tyle różnych systemach sugerowała, że efekt nie jest kwestią przypadku dla jednego konkretnego białka, ale coś związanego z podstawową chemią jonów. Warto zauważyć, że aniony w ogólności pokazują silniejszy i bardziej zgodny efekt Hofmeistera niż kationy, co samej siebie wskazuje na końcową, bardziej nuansowaną interpretację dotyczącą bezpośrednich interakcji jonów z załadowanymi lub półprzewodnikowymi grupami na powierzchni macromoleculi. Początkowe prace Hofmeistera z 1888 roku, opublikowane w niemieckich czasopismach farmakologicznych, opisywały setki dokładnych titracji przypadania, a jego rangowanie okazało się wystarczająco trwałe, aby nadal być powtarzane dzisiaj w laboratoriach z podobną względową kolejnością, nawet jeśli białka, bufora i instrumenty używane dzisiaj byłyby dla niego niemal niewspominane.

Klasyczna interpretacja: struktura wody tworząca i zrzucająca

Obejmując okres ponad sto lat po badaniach Hofmeistera, dominującą interpretacją było pojęcie struktury wody. Iony kosmotropowe, jak się powiedziało, są silnie hydratowane: skutecznie przyciągają molekuły wody i stabilizują istniejącą sieć węzłową wodorotwórczą wokół nich. Ponieważ te iony zasysają wodę i stabilizują jej strukturę, pozostawiają mniej 'swobodnej' wody dostępnej do hydratowania i rozpuszczania rozpuszczonych protein, co efektywnie spowalnia i promuluje sykot. Ionami chaotropicznymi uważano za działanie na odwrotną stronę. Były one duże, słabo hydratowane i często polarne (np. thiocyanat i iod). Wierzyło się, że zrzucają strukturę wodorotwórczą wody woluminowej, sprawiając, że jest ona bardziej nieuporządkowana lub 'zrzucona.' Ta zrzucanie powodowało przypuszczenie, że woda ma większą zdolność do solwacji protein, trzymając je w rozpuszczonym stanie i nawet odsłaniając je na wystarczająco wysokich koncentracjach. Takie pojęcie tworzenia i zrzucającego struktury miało prawdziwe przyciągające do wyjaśnienia. Połączało się w sposób elegancki z właściwościami ionów, takimi jak współczynnik B Jones-Dole, który pomiaruje, jak ion wpływa na viskozyczność wody, oraz mierzeniach entropii hydratacji. Kosmotrope zwykle mają ujemną entropię hydratacji i lekko zwiększają viskozyczność rozpuszczalnika; chaotrope mają dodatnią entropię hydratacji i mogą lekko zmniejszać viskozyczność. Te zależności wydawały się wspierać ideę, że iony dotykają się molekuł wody poza ich bezpośrednim sferą koordynacji, really a prawdziwie długookresowe działanie przekazywane przez sieć wodorotwórczą. Model struktury woluminowej dominował w podręcznikach nauczycielskich przez dekadę i nadal jest uczony jako pierwsza przybliżona interpretacja, ponieważ daje studentom intuicyjne obraz mentalny. Jednakże, gdy technologie spektroskopowe zdolne do bezpośredniego przyszczepienia się do dynamicznych procesów w molowym czasie stały się dostępne od lat 90. i 2000., ta interpretacja zaczęła się rozpadnąć pod bliższym badaniem, przygotowując drogę do znaczącej rewizji zrozumienia tego obszaru naukowego.

CoUltrafast Spectroscopia Wystąpiła

Kryzys nastąpił dzięki technikom umożliwiającym obserwację reorientacji pojedynczych cząsteczek wody na skalach femtosekundowych do picosekundowych, głównie ultrafast infrared pump-probe spectroscopy i pomiarów Kerra optycznego o mikrosekundowej trwałości, które zostały opracowane w tym kontekście przez badaczy takich jak Huib Bakker, Richard Saykally oraz inni w latach 2000-2010. Te eksperymenty pomiarowe mierzą szybkość rozpuszczania i reorientacji sieci gęstwieniowej wody po jej perturbacji, dając bezpośrednie odczyty, czy ion jest naprawdę zmieniającym strukturę wody na dużej odległości. Wyniki były zaskakujące. Zgodnie z modeliem klasycznym, większość iónów, w tym silne kosmotropy jak sulfat, okazały się wpływać tylko na reorientację cząsteczek wody w ich bezpośrednim pierwszym sferze hydracji, co zwykle oznacza jedno lub dwa warstwy molekularne. Po około jednym nanometrze od iona, dynamika wody na dużych skalach wyglądała niemal niezmienniczo, podobnie jak u czystej wody. To bezpośrednio sprzeciwiało się idei, że kosmotropne ióny somehow reorganizują cząsteczki wody na wielu warstwach oddalonej. Jeśli iony nie są zmieniającymi struktury wody na długich odległościach, coś innego musi wyjaśniać dlaczego sulfat zasypia proteiny, a thiocyanat je rozpuszcza. Wzmacniający obraz, rozwijany dzięki pracy badaczy takich jak Paul Cremer, Pavel Jungwirth i innych, wskazuje na bezpośrednie, specyficzne interakcje między ionami a własną powierzchnią makromolekuła, szczególnie jego szkielet amidy, załadowane łańcuchy boczne oraz cienka warstwa hydracji natychmiastowa okoliczna. Ionów chaotycznych jak thiocyanat i iod, są duże, miękkie i polarizowalne, więc mogą adsorbuować się na słabo polarnej lub hydrofobicznej powierzchni proteinowej, efektywnie pokrywając ją i stabilizując w roztworze. Ionów kosmotropnych jak sulfat są małe, silnie hydrowane i podstawowo wykluczone z powierzchni proteinowej; to wykluczenie (często nazywane preferencyjną hydracją lub efektem objętościowego wykluczenia) podnosi skuteczną koncentrację proteinu względem wody i prowadzi do minimalizacji powierzchniowej przez agregację i zasypianie. Warto zaznaczyć, że to nie jest jeszcze rozstrzygnięte pytanie. Różne grupy badawcze nadal podkreślają różne równania między termodynamicą objętościowego wykluczenia, bezpośrednim skutkiem adsorpcji ionów, efektem napięcia powierzchniowego i przetrwałymi skutkami mediatora wody. Relatywna ważność każdego z mechanizmów może się zmieniać w zależności od konkretnego proteinu, jego chemii powierzchniowej oraz warunków roztworu. To, co jest teraz szeroko zgodne, to fakt, że stara, prosta historia o tym, jak iony biegają przez strukturę wody na długich odległościach, jest najlepiej mówiąc, małym przyczynnikiem dla większości iónów. Główne fizyka jest znacznie bardziej lokalna niż mogli sobie wyobrazić współczesni Hofmeister.

Kryzystalizacja i wyciądzanie proteinów na praktyce

Dawniej, zanim mechanizm był zrozumiały, biochemicy wykorzystywali serię Hofmeistera empirycznie: ta praktyczna wiedza pozostaje kluczowa dla pracy laboratoriowej do dziś. Zanieczyszczenie jonowe amonu sulfatowego jest najbardziej szeroko stosowanym technikiem wyciądzania proteinów na świecie: ponieważ jon sulfat znajduje się blisko końcowej, silnie kosmotropnej części serii jonów anionowych a jon amonu jest względnie kosmotropiczny, sulfat amonu jest niezwykle skutecznym środkiem do zanieczyszczenia protein z leśnych extractów. Biochemicy wykorzystują to dodając sulfat amonu w kontrolowanych etapach: najpierw zanieczyszczają niewybrane proteinie na niższych koncentracjach, a następnie zanieczyszczają interesujący protein na wyższej koncentracji, technika zwana ułamkowym lub różnicowym zanieczyszczeniem. W kryzystalizacji protein, zestawy do ekspresji zamiernie zawierają szeroką gamę jonów Hofmeistera, od silnie kosmotropnych sulfatów i fosfatów po bardziej chaotyczne thiocyanaty i nitraty, ponieważ różne proteinie kryzystalizują najlepiej w różnych punktach serii. Jon kosmotropiczny może być potrzebny do łagodnego zmniejszenia solubiwości proteinu tylko o tyle, aby zacząć formować uporządkowane kryształy, a nie chaotyczne zanieczyszczenie, podczas gdy lekko bardziej chaotyczna warunki mogą być potrzebne dla proteinie, które tendują do agregowania za szybko. Kryzystalografowie regularnie ekspresji dziesiątki warunków rozciągniętego spektrum, ponieważ nie ma sposobu przewidzenia w advance, który punkt będzie działał dla nowego proteinie. W chromatografii, kolumny interakcji higrofobicznej (HIC) korzystają bezpośrednio z zachowania Hofmeistera: proteinie są załadowywane na lekko higrofobiczną resztę w buforze zawierającym wysokiej kosmotropu jonów, co prowadzi do zanieszczenia pasków higrofobicznych na powierzchni proteinie do wiązania się z resztą, a elucyto można osiągnąć prosto sprowadzając koncentrację jonów, aplikacja, która jest w podstawie kontrolowym i odwracalnym zanieczyszczeniem przez zanieczyszczenie wykonanym na kolumnie zamiast w testowiej butele. Ostatecznie, w formułowaniu leków, zrozumienie, gdzie jon wstępujący lub stabilizujący dodatek znajduje się na serii Hofmeistera pomaga formulatorom wybierać składniki, które utrzymują proteinie terapeutyczne, takie jak antybody monoclonalne, skupione i solublne podczas przechowywania i transportu, unikając agregacji, która mogłaby zmniejszyć efektywność lub wywołać reakcje immunologiczne u pacjentów. Dodatki takie jak sukrose, trehalosa i konkretny bufor jonowy są wybierane częściowo na podstawie znanych ich położenia wzdłuż, lub korelacji z zachowaniem typu Hofmeistera.

Wybieranie Prawidłowego Solwuatu: Praktyczny Framework

Dla pracującego biochemika, decydującego się na wybrany solwuat, seria Hofmeistera oferuje niezwykle przydatne przewodniczące zasady nawet bez pełnego wyjaśnienia mechanizmu. W ciągu lat doświadczeń laboratoriowych wyróżniły się kilka praktycznych porad. Gdy cel polega na koncentracji lub precipitacji protein, nie spowodując jej dezaktywacji, solwuaty kosmotropowe bliskie końcowym pozycjom serii (np. sulfat i fosfat) są domyślną wyborą. Sulfat amonu jest szczególnie popularny ze względu na jego dużą rozpuszczalność (co pozwala osiągnąć bardzo wysoką siłę ioniczną), niskie ceny oraz łagodne działanie na większości proteinów globularnych, co prawie nigdy nie powoduje irytowalnego rozplątywania nawet w bliskim do satywacyjnej koncentracji. Gdy cel polega na utrzymaniu solubliwności protein lub dyskretowaniu niechcianych interakcji protein-proteinowe lub protein-nukleinowe, wykorzystywane są solwuaty chaotropowe lub dodawki, takie jak sodio thiocyanat, chlonat guanidynu czy uręa (która zachowuje się podobnie do chaotropu, choć sama nie jest prostym solwuatem). Guanidyn chlonat, w szczególności, jest pracującym chaotropowym dezaktywatem wykorzystywanym do rozplątywania i solubliwania protein z zawiesin w procesach odrestawiania rekombinanowych proteinów. Gdy potrzebna jest neutralna, fizjologicznie kompatybilna siła ioniczna, sodiu chlonat jest domyślnym wyborem, dokładnie dlatego, że leży blisko środka serii i ma tylko łagodne cechy Hofmeistera, co minimalizuje niechciane efekty solting-in lub solting-out, podczas gdy nadal dostarcza siłę ioniczną potrzebną do osłabienia interakcji elektrycznych. Warto też pamiętać, że seria może się przesunąć somewhat, czy nawet częściowo obrócić dla małej grupy protein, w zależności od netowej ładunkowości i chemii powierzchniowej konkretnego makromolekuła, szczególnie blisko punktu izoelektrycznego. To dokładnie takie zachowanie proteinospecyficzne przewidowane jest przez nowoczesny model lokalnych interakcji, a nie starszy model wody gęstej, ponieważ chemia powierzchniowa proteinu, a nie tylko zasada solwuatów, pomaga wyznaczyć, jak silnie dana jonizacja interaguje z nim. Ze względu na tę zmienność większość doświadczonej procedur nadal polega na empierycznym badaniu serii zamiast bezwzględnej oparcia się porządku zapisanego w podręcznikach, traktując rangę Hofmeistera jako dobry początek, a nie absolutną prawdę.

Często zadawane pytania