Kinetyka enzymatyczna: krzywa Michaelisa-Mentena i jego inhibitory

Model Michaelisa-Mentena

Enzyt E wiąże się z substratem S, tworząc kompleks ES, który albo wraca do stanu początkowego, albo przechodzi dalej do produktu P, zwalniając enzytom niezmieniony:

E + S ⇌(k1,k-1) ES →(k2) E + P Leonor Michaelis i Maud Menten (1913), opierając się na wcześniejszych badaniach Victora Henrika, zastosowali przybliżenie stanu równowagi — zakładając, że kompleks ES tworzy się i rozkłada się w tych samych prędkościach po osiągnięciu ustalonego stanu reakcji — do wyliczenia prędkości formacji produktu jako funkcję koncentracji substratu:

v = Vmax [S] / (Km + [S]) demonstrator live · krzywa zanurzania v vs [S] zmieniająca się wraz z Km i Vmax● LIVE Vmax to maksymalna prędkość, osiągana tylko przy [S] → ∞, gdy każda cząsteczka enzytu jest zasaturaowana substratem: Vmax = k2·[E]total. Km, stała Michaelisa, to koncentracja substratu, dla której v = Vmax/2 — praktyczna miara apparentnej wiarygodności enzytu dla swojego substratu (niska wartość Km oznacza, że enzyt osiąga połowe zasaturaowania przy niskiej [S], co oznacza silne powiązanie; formalnie Km = (k-1 + k2)/k1).

E + S  ⇌(k1,k-1)  ES  →(k2)  E + P

Dlaczego krzywa jest hiperbolią, a nie linią

Na niskich koncentracjach [S] v jest prawie proporcjonalny do [S] (pierwszego rzędu w odniesieniu do substratu), ponieważ większość enzymów znajduje się wolna i gotowa do reakcji z tym, co dotrze. Na wysokich koncentracjach [S], prawie każda cząsteczka enzymu jest już zajęta, więc v osiąga stałą wartość Vmax, niezależnie od tego, ile więcej substratu dodamy (zero rzędu w odniesieniu do substratu) — teraz reakcja ogranicza się do szybkości przekształcenia ES w produkt, a nie do ilości S. Przejście od liniowego wzrostu do płaskiego jest dokładnie hiperbolą prostokątną.

Liniowana to: plot Lineweaver-Burk

Ocena hiperboli wzrokiem jest niepewna, więc przed regularnym użyciem regresji nieliniowej biochemicyści odwrotnie przekształcają równanie w prostą linię — plot double-reciprokal Lineweaver-Burk:

1/v = (Km/Vmax)·(1/[S]) + 1/Vmax Narysowanie 1/v przeciwko 1/[S] daje linię, której nachylenie jest równe Km/Vmax, a punkt przecięcia z osią y wynosi 1/Vmax. Punkt przecięcia z osią x ma wartość −1/Km. Nadal nauczane jest to, ponieważ pozwala ono wizualnie wykryć typ inhibicji, nawet jeśli przeskalowuje błędy eksperymentalne przy niskich [S] (małe błędy w v stają się ogromne błędy w 1/v) i współczynnik kinetyki współcześnie oblicza hiperbolę nieprzekształconą numerycznie.

1/v = (Km/Vmax)·(1/[S]) + 1/Vmax

Trzy sposoby na zablokowanie maszyny

Inhibicja konkurencyjna: inhibitor strukturalnie podobny do substratu competuje za to samo miejsce aktywne. Mogą być zawsze wygrane przez wystarczającą ilość substratu, więc Vmax pozostaje niezmieniony, ale apparentna Km wzrasta (potrzebna jest więcej substytutu, aby osiągnąć połowe satysfakcji). Na diagramie Lineweaver-Burk linie inhibitorów konkurencyjnych mają tę samą wartość wsiadania (Vmax pozostaje niezmieniony), ale stężenie się uciążliwe.

Inhibicja niokonkurencyjna: inhibitor wiąże się z innym punktem allosterycznym, na wolnym enzymie lub w złożeniu ES, przekształcając geometrię miejsca aktywnego bez blokowania wiązania substratu. Dodawanie więcej substytutu nie może ocalić tego stanu, więc Vmax spada; w przypadku czystym (symetrycznym) inhibitor zmienia tylko przerobienie, a nie silność wiązania S, dlatego apparentna Km pozostaje niezmieniona.

Inhibicja unokonkurencyjna: inhibitor wiąże się tylko z złożeniem ES, nie z wolnym enzymem. Obie Vmax i apparentna Km zmniejszają się o ten sam czynnik — niewiadomie, enzym wydaje się wiązać się z substratem bardziej mocno, ponieważ zaciąganie ES z równowagi (zamknięcie go jako ESI) przesuwa równowagę między E+S ⇌ ES w stronę większej formacji ES, nawet jeśli mniej złożenek ES osiąga koncepcję produktu.

Dlaczego to ważne poza salą nauczania

Kinetyka Michaelisa-Mentena i wzory inhibicji są językiem farmakologii (większość leków jest inhibitory konkurencyjne lub niekonkurencyjne enzymatyczne lub receptorowe), genetyki metabolicznej (wartości Km i Vmax powiadamiają, który enzym w ścieżce jest brzegiem oporowym) oraz diagnostyki (wiele badan klinicznych mierzy cel poprzez to, jak perturbuje on kinetykę dobrze znanego enzymu).

Często zadawane pytania