Як це працює
Суміш трьох аналізованих сполук завантажується на верхівку колонки, заповненої нерухомою фазою (наприклад, силікагелем), і розчинник рухомої фази безперервно тече вниз. Кожна розчинена частинка проводить частину часу, зв'язана з нерухомою фазою (пауза), і частину часу, переносячись рухомою фазою (рух вниз), випадково перемикаючись між цими двома станами. Частка часу, яку сполука проводить у рухомій фазі, дорівнює 1/(1+K), де K — її коефіцієнт розподілу — рівноважне співвідношення між тим, наскільки вона надає перевагу нерухомій фазі над рухомою.
Оскільки кожна сполука має власний K, їхні середні швидкості руху вниз відрізняються, і три спочатку перекриті смуги поступово розділяються, рухаючись колонкою. Коли частинка досягає низу, вона "елюює", і детектор фіксує час її прибуття, формуючи хроматограму праворуч — трасу з трьох розділених піків, де сполука з найнижчим K з'являється першою, а сполука з найвищим K — останньою.
Середня швидкість: v = u/(1+K) [u = швидкість рухомої фази]
Час утримування: tR = L·(1+K)/u [L = довжина колонки]
Роздільна здатність: Rs = 2·(tR2 − tR1)/(w1 + w2)
Часті запитання
Що розділяє хроматографія і в чому загальний принцип?
Хроматографія розділяє компоненти суміші, використовуючи те, наскільки по-різному кожен з них взаємодіє з двома фазами: нерухомою фазою (упакований твердий матеріал або покриття) та рухомою фазою (рідкий чи газовий розчинник). Кожна сполука безперервно розподіляється між двома фазами, і оскільки кожна проводить різну частку часу, адсорбовану нерухомою фазою, порівняно з перенесенням рухомою фазою, вони рухаються системою з різною швидкістю та виходять розділеними в часі.
Що означає коефіцієнт розподілу K?
Коефіцієнт розподілу K — це відношення концентрації (або часу перебування) сполуки в нерухомій фазі до її концентрації в рухомій фазі при рівновазі. Низький K означає, що сполука надає перевагу рухомій фазі й рухається швидко; високий K означає, що вона надає перевагу нерухомій фазі й відстає. K залежить від хімії сполуки та обох фаз — важливі полярність, водневі зв'язки та розмір.
Як K впливає на час утримування?
Середня швидкість руху сполуки через колонку дорівнює швидкості рухомої фази, поділеній на (1 + K), тому час утримування масштабується як tR = L·(1+K)/u, де L — довжина колонки, а u — швидкість рухомої фази. Сполуки з вищим K потребують пропорційно більше часу для елюювання, і саме це створює розділення в часі, яке видно на хроматограмі.
Чому сполуки з різною полярністю чи спорідненістю розділяються за однакових умов?
Хоча кожна молекула стикається з однаковою хімією нерухомої та рухомої фаз, власна структура кожної сполуки (полярні групи, розмір, заряд, гідрофобність) визначає, наскільки сильно вона притягується до нерухомої фази відносно рухомої. Ця структурна різниця робить коефіцієнти розподілу K різними, і саме різні значення K є причиною того, що за інакше однакових умов потоку суміш все одно розділяється на окремі смуги.
Що таке хроматограма і як її читати?
Хроматограма показує сигнал детектора (вісь y) відносно часу або об'єму елюату (вісь x) у міру виходу сполук з колонки. Положення кожного піка вздовж осі x — це його час утримування, який ідентифікує сполуку; площа піка (або висота, для подібних форм піків) приблизно пропорційна кількості цієї сполуки в початковому зразку.
Що таке фактор утримування k' і як він пов'язаний з K?
Фактор утримування k' (також пишеться k) — практична безрозмірна міра утримування, визначена як k' = K·(Vs/Vm), коефіцієнт розподілу, помножений на відношення об'єму нерухомої фази до об'єму рухомої фази в колонці. Коли обидва об'єми фаз приблизно рівні, k' близько відображає сам K, а tR = tM·(1 + k'), де tM — час, за який неутримувана сполука пройшла б колонку.
Чим колонкова/гравітаційна хроматографія відрізняється від ВЕРХ, ГХ і ТШХ?
Усі ці методи використовують той самий принцип розподілу, але відрізняються фазами та рушійною силою: класична колонкова хроматографія використовує рідину під дією гравітації через упаковану кремнеземну колонку; ВЕРХ подає рідину під високим тиском через колонку з дрібними частинками для швидшого й чіткішого розділення; ГХ використовує інертний газ-носій через нагріту капілярну колонку, придатну для летких сполук; ТШХ використовує пласку пластину з нерухомою фазою та капілярну дію замість накачуваного потоку, що робить її швидкою й простою для якісних перевірок.
Що означає роздільна здатність між піками і що на неї впливає?
Роздільна здатність Rs кількісно оцінює, наскільки чітко розділені два сусідні піки: Rs = 2·(tR2 − tR1)/(w1 + w2), різниця часів утримування, поділена на середню ширину піка. Роздільна здатність покращується з більшою різницею K між сполуками, з довшою або ефективнішою колонкою (вужчі піки) та загалом з повільнішою швидкістю потоку, оскільки повільніший потік дає більше часу для встановлення рівноваги між фазами — хоча це й подовжує тривалість аналізу.
Які реальні застосування має хроматографія?
Хроматографія є центральною для очищення ліків і контролю якості у фармацевтичному виробництві, для судово-медичного та допінг-аналізу та для екологічного контролю забруднювачів у воді й ґрунті. Сама назва методу — «кольорове письмо» — походить від експерименту Михайла Цвєта 1901 року, який розділив рослинні пігменти (хлорофіли й каротиноїди) на видимі кольорові смуги на колонці з карбонату кальцію, першої демонстрації методу.